摘要
结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发生被认为与饮食、环境、遗传等密切相关。随着饮食习惯及生活环境的迅速改变，我国结直肠癌的发病率也不断攀升。虽然诊疗癌症的技术不断发展，但超过40％的结直肠癌患者不可避免的死于肿瘤的复发和转移。众所周知化疗是控制包括结直肠癌等癌症的重要手段之一，肿瘤细胞的多药耐药性是目前临床上化疗失败的主要原因。因此，揭示结直肠癌的化疗药物耐受和侵袭转移的分子机制对于临床治疗结直肠癌至关重要。 长链非编码RNA（lncRNAs）是一类转录本长度介于200nt-100kb之间的不编码或很少编码蛋白质的RNA分子。LncRNAs通过与各种生物大分子如DNA、染色质、蛋白质和RNAs(包括mRNAs、microRNAs和lncRNAs)相互作用，参与多种细胞或者生物进程。近年来研究表明，lncRNAs在人类多种癌症中异常表达，可参与表观遗传修饰、转录调控、RNA编辑以及蛋白翻译和修饰等重要细胞分子活动，调控肿瘤的发生、生长、凋亡、侵袭转移、代谢等过程。LncRNAs在结直肠癌存在差异性表达并与结直肠癌的生长、远处转移及总体生存率有关，也可作为分子标记物预测结直肠癌患者的预后。LncRNAs不仅影响肿瘤细胞本身，而且也影响肿瘤微环境中的其它细胞。肿瘤微环境是由肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与肿瘤细胞共同构成的局部微环境。其中肿瘤细胞中具有干细胞样特征的细胞亚群被称为肿瘤干细胞，这群细胞在癌症的发生、复发、转移和化疗耐药等过程中发挥独特的作用。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中最主要的间质细胞，通过旁分泌过程在肿瘤增殖，转移，血管生成和化疗耐药中发挥重要作用。可是，迄今关于lncRNAs与CAFs的关系及其对结直肠癌的发生、干性的维持和化疗药物耐受过程的作用尚不清楚。 本研究首先利用全转录测序技术分析了诱发性结肠癌小鼠模型组织样本，筛选出了差异性表达的lncRNAH19，同时在TCGA数据库中分析了lncRNAH19不同分期的结直肠癌的表达情况，并探究了结直肠癌样本中lncRNAH19表达与结直肠癌干性相关性。通过体内外实验确认了lncRNAH19对结直肠癌干细胞干性和奥沙利铂耐药性的影响。进一步探究了结直肠癌中lncRNAH19的上游调控机理，并揭示了lncRNAH19下游调控结直肠癌干性和耐药性的具体分子机制。本研究加深了我们对结直肠癌发生、结直肠癌干性的维持和化疗药物耐受过程的理解，为结直肠癌的临床治疗提供了新的思路和靶标。 1.LncRNAH19促进结直肠癌干细胞特性和奥沙利铂耐药性 本研究首先建立了诱发性结直肠癌小鼠模型(CAC)并对组织全转录测序分析，筛选出了差异性表达的lncRNAH19。通过对模型样本mRNA测序结果通路分析发现了一些变化明显的关键信号通路如细胞粘附分子、异生素代谢、炎症性肠病和药物代谢等。同时，我们分析了lncRNAH19在TCGA数据库中的不同结直肠癌分期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期和转移性Ⅳ期）的测序数据。结果显示，相对于正常组织(averageTPM=2.85)lncRNAH19在结直肠癌数据集(averageTPM=18.32-72.47)明显处于高水平(adjustedP-values1.33E-08-4.76E-03)。我们发现lncRNAH19水平在结直肠癌发生早期就显著上调，随着结直肠癌的发展而进一步增加。另外，与Ⅳ期相比，转移性Ⅳ期的结直肠癌组织中lncRNAH19的表达也增加。同时，我们在结直肠癌样本中对lncRNAH19的表达做了进一步验证，并发现了LncRNAH19水平与结直肠癌干性标志的表达存在相关性。 为了进一步探究LncRNAH19对结直肠癌细胞干性的影响，我们对结直肠癌细胞LncRNAH19进行了过表达或干扰。结果显示，结直肠癌细胞中过表达LncRNAH19明显促进了多能性转录因子和肿瘤干细胞标志物的表达，并上调结直肠癌ALDH1high细胞的比例。在功能上进一步探究发现，lncRNAH19过表达明显促进了结直肠癌细胞成球的能力。反之，lncRNAH19干扰明显抑制了结直肠癌细胞成球的能力。鉴于肿瘤干细胞对化疗药物耐受的重要作用，我们推断lncRNAH19能够促进结直肠癌对化疗药物的耐受。我们通过结直肠癌广泛使用的常规一线化疗药物（奥沙利铂）来评估了结直肠癌细胞的化疗敏感性。结果显示，lncRNAH19过表达显著增强了结直肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性。 接下来我们用慢病毒载体构建了稳定干扰lncRNAH19的结直肠癌细胞系，并通过体内有限稀释成瘤试验探究结直肠癌细胞干性的功能改变。结果显示lncRNAH19敲低明显减低了肿瘤起始频率，减弱了结直肠癌细胞的体内肿瘤形成能力。为了探究在体内lncRNAH19对结直肠癌奥沙利铂耐药性的影响，我们通过lncRNAH19稳定低表达结直肠癌细胞建立了小鼠异种移植模型。结果显示，在奥沙利铂的治疗下，lncRNAH19的敲低显著地抑制肿瘤生长，增强奥沙利铂对结直肠癌细胞的杀伤效果。另外，lncRNAH19的敲低明显减少Ki-67阳性细胞的数目，增加组织中切割的caspase-3的表达，促进肿瘤组织中细胞凋亡。这些结果显示，lncRNAH19具有促进结直肠癌细胞干性和化疗药物耐受的作用。 2.CAFs通过外泌体转移lncRNAH19调控结直肠癌的干性和耐药性 为了进一步探索lncRNAH19在结直肠癌中作用，我们通过RNA-FISH和免疫荧光实验评估了lncRNAH19在癌巢(pan-CK-阳性)和肿瘤基质（α-SMA-阳性）中的组织定位和表达情况。有趣的是，结直肠癌的癌巢和肿瘤基质都表现出高lncRNAH19水平，而且发现lncRNAH19在肿瘤基质中的水平明显高于癌巢。为了进一步证实lncRNAH19在肿瘤基质中的表达，我们分别从结直肠癌组织和相邻的正常结肠组织中分离CAFs和正常成纤维细胞(NFs)，并鉴定了原代NFs和CAFs的纯度和表型。结果显示，结直肠癌原代CAFs中lncRNAH19的表达明显高于NFs。我们用CAFs来源条件培养基(CAF-CM)和NFs来源条件培养基(NF-CM)来处理人结直肠癌细胞，检测结直肠癌干细胞的标志和功能。结果显示与NF-CM处理相比，用CAF-CM处理显著增加了结直肠癌细胞的ALDH1high细胞的比例，增强了结直肠癌细胞的细胞成球能力，降低了结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，促进了对奥沙利铂的耐受。进一步通过外泌体抑制剂(GW4869)阻断外泌体分泌发现CAFs可能通过释放外泌体来增强结直肠癌细胞的干细胞特性和耐药性。另外我们发现CAFs上调结直肠癌细胞中lncRNAH19水平，并且证明了外泌体参与了此过程。同时，我们通过TGF-β受体Ⅰ的抑制剂使用排除了TGF-β途径的参与。 为了进一步证实CAFs来源的外泌体的作用，我们分别分离CAFs和NFs来源的外泌体，并进行鉴定。接下来我们证明结直肠癌细胞有效摄入CAFs衍生的外泌体的过程。既然CAFs通过分泌外泌体被结直肠癌细胞摄入并增加细胞lncRNAH19水平，而且CAFs高表达lncRNAH19，我们怀疑是否CAFs分泌的外泌体中携带了lncRNAH19?惊喜的是，我们在CAFs来源的外泌体中检测到了高水平的lncRNAH19，而对应的NFs来源的外泌体lncRNAH19含量较低。进一步的实验发现，CAFs来源的外泌体与结直肠癌细胞培养均能够明显提高细胞内lncRNAH19水平。以上结果表明，lncRNAH19富集于CAFs衍生的外泌体，并且可以从CAFs转移至结直肠癌细胞，进而调控结直肠癌细胞lncRNAH19水平。 接下来我们继续探索CAFs来源的外泌体对结直肠癌的作用。将结直肠癌细胞与CAFs或NFs细胞的外泌体共孵育，之后评估结直肠癌细胞干性和奥沙利铂耐药性。与NFs的外泌体相比，CAFs衍生的外泌体处理增加结直肠癌细胞肿瘤干细胞成球能力，增加ALDHhigh细胞的比例，并促进了对奥沙利铂的药物抵抗。体内耐药实验显示，单独奥沙利铂治疗有着明显的抑制肿瘤的生长的效果，而CAFs来源的外泌体处理减弱并逆转奥沙利铂对肿瘤的杀伤作用。进一步检测发现CAFs来源的外泌体处理也增强肿瘤组织Ki-67的表达，降低奥沙利铂诱导的切割caspase-3的水平并减弱奥沙利铂诱导的细胞凋亡。另外，与NFs来源的外泌体处理组相比，CAFs来源的外泌体处理显著增加了肿瘤组织中lncRNAH19的水平。以上结果表明，CAFs来源的外泌体在体内通过转移lncRNAH19促进结直肠癌的干性和奥沙利铂耐受。 3.CAFs来源的外泌体调控结直肠癌Wnt/β-catenin通路机制探究 鉴于Wnt/β-catenin通路对肠干细胞功能，肿瘤干细胞干性的维持和化疗药物的耐受等方面的重要的作用，我们推测Wnt/β-catenin通路在结直肠癌中受lncRNAH19调控。首先，我们发现lncRNAH19的过表达上调Wnt萤光素酶报告(TOPFlash)活性并显著增加β-catenin的蛋白质水平。我们进一步发现CAFs来源的外泌体显著促进结直肠癌细胞中β-catenin的表达。我们还分析了前面两个异种移植模型中肿瘤组织中β-catenin的表达。与NFs来源外泌体处理组相比，CAFs来源外泌体处理显著增加肿瘤组织中β-catenin的蛋白质水平，敲低lncRNAH19显著地降低肿瘤组织中β-catenin水平。这些结果表明外泌体转移的lncRNAH19在结直肠癌中激活了Wnt/β-catenin通路。 越来越多的证据显示，lncRNAH19可以通过内源性“海绵”吸附miRNA的方式参与多种生物过程的调控。我们通过RNA免疫沉淀证明了lncRNAH19可能与结直肠癌细胞中的miRNA发生功能性相互作用。序列分析和生物信息学预测分析显示lncRNAH19和miR-141之间的假定结合位点，表明对lncRNAH19来说，miR-141具有ceRNA的潜力。因此，我们接下来通过双荧光素酶报告实验证实lncRNAH19可以通过预测的结合位点直接与miR-141相互作用。我们还证实β-catenin在结直肠癌细胞中是miR-141的靶标，并且证明lncRNAH19通过与miR-141相互作用来调节β-catenin的表达。另外，我们通过检测ALDH1high细胞群和肿瘤成球能力实验发现miR-141能够调控结直肠癌细胞的干性的功能。最后通过对结直肠癌标本的进一步分析，我们发现lncRNAH19的表达与标本中β-catenin的免疫染色评分呈正相关关系。临床样本结果也印证了我们在结直肠癌细胞和动物模型上得出的结论。以上结果显示，CAFs来源的外泌体转移lncRNAH19到结直肠癌细胞，lncRNAH19通过竞争性吸附miR-141的方式活化结直肠癌Wnt/β-catenin通路，进而促进结直肠癌细胞的干性和耐药性。 综上所述:(1)我们分析了lncRNAsH19和CAFs在结直肠癌干性维持和奥沙利铂耐药中的作用;(2)发现CAFs衍生的外泌体是lncRNAH19向结直肠癌细胞转移的主要途径;(3)阐明了CAFs衍生的外泌体通过转移lncRNAH19激活Wnt/β-catenin信号的潜在分子机制。此外，我们的研究结果提示，靶向CAFs的lncRNAH19或Wnt/β-catenin信号的治疗与化学治疗药物联合可能有效抑制肿瘤干细胞干性及克服结直肠癌微环境介导的耐药性。
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