摘要
第一部分临床研究 目的: 观察加减益经汤治疗卵巢储备功能减退(DOR)患者的临床疗效，并研究该方通过调节Th17/Treg免疫平衡，从而改善卵巢功能的可能机制。 方法: 将2020年3月至2021年5月就诊于广州市妇女儿童医疗中心门诊且符合诊断标准的DOR患者63例，随机分为中药组（加减益经汤组）32例，西药组（雌孕激素序贯疗法组）31例;其中中药组剔除2例，西药组剔除1例，实际中药组完成30例，西药组完成30例。 中药组:于入组后的第一次月经干净后的第一天开始服用加减益经汤，日一剂，经期停服（若超过45天月经未来潮者，改服地屈孕酮20mg/d×10d），下次月经干净后第一天再服下一周期，共服用6个月经周期。 西药组:于月经的第5天开始服用补佳乐2mg/日×21天十地屈孕酮片20mg/日×10天（地屈孕酮片于服用补佳乐的第12天开始加服），共服用6个月经周期。 比较两组患者治疗前后中医症状积分、血基础促卵泡刺激素(bFSH)、基础促黄体生成素(bLH)、基础雌二醇(bE2)、抗苗勒氏激素(AMH)、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞17(Th17)和白介素-10(IL-10)、白介素-17A(IL-17A)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ（IFN-γ）、窦卵泡数(AFC)、两组治疗后妊娠率及疗效的差异。 结果: 1.两组中医症候积分比较:中药组和西药组治疗前各中医症候积分比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。中药组和西药组各中医症候积分治疗后比治疗前均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;其中，中药组治疗后“月经量、月经血质、腰骶酸痛、乳房胀痛”的积分明显低于西药组治疗后，差异有统计学意义(P＜0.05);西药组治疗后“月经周期”积分明显低于中药组治疗后，差异有统计学意义(P＜0.05)。在总积分方面，中药组和西药组治疗前比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性;中药组和西药组治疗后中医症候总积分比治疗前，均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);中药组治疗后中医症候总积分明显低于西药组治疗后，差异有统计学意义（P＜0.05）。 2.两组血清bFSH、bLH、bE2、AMH的比较:中药组和西药组治疗前bFSH、bLH、bE2、AMH比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中药组和西药组治疗后bFSH、bLH比治疗前均显著降低，bE2、AMH比治疗前显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。中药组和西药组治疗后bFSH、bLH、AMH组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，西药组治疗后bE2与中药组治疗后比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。中药组和西药组bFSH、bLH、AMH治疗前后差值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，西药组bE2治疗前后差值明显高于加减益经汤组治疗前后差值，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.两组血清Treg、Th17比例的比较:中药组和西药组治疗前Treg、Th17比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中药组和西药组治疗后Treg比例对比治疗前显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）;中药组和西药组治疗后Th17比例对比治疗前显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。中药组治疗后Treg比例与西药组治疗后比较，差异无统计学意义(P＞0.05);中药组治疗后Th17比例明显低于西药组治疗后，差异有统计学意义（P＜0.05）。中药组和西药组的Treg比例治疗前后差值比较，差异无统计学意义(P＞0.05);中药组Th17比例治疗前后差值明显高于西药组治疗前后差值，差异有统计学意义(P＜0.05)。 4.两组血清IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ的比较:中药组和西药组治疗前IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。中药组和西药组治疗后IL-17A、TNF-α、IFN-γ对比治疗前均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);中药组和西药组治疗后IL-10对比治疗前显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。中药组治疗后IL-17A、TNF-α、IFN-γ明显低于西药组治疗后，差异有统计学意义(P＜0.05);中药组治疗后IL-10与西药组治疗后比较，差异无统计学意义(P＜0.05)。中药组IL-17A、TNF-α、IFN-γ治疗前后差值明显高于西药组治疗前后差值，差异有统计学意义(P＜0.05);中药组IL-10治疗前后的差值与西药组治疗前后差值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 5.两组妊娠率的比较:中药组和西药组治疗前AFC比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。中药组和西药组治疗后AFC对比治疗前，均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。中药组和西药组治疗后AFC比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。中药组和西药组AFC治疗前后差值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。 6.两组妊娠率的比较:中药组中不孕症患者有12例，西药组中不孕症患者有13例，治疗后中药组妊娠5例，西药组妊娠3例，虽然两组的妊娠率比较无统计学意义，但是中药组的妊娠率高于西药组。 7.两组疗效比较:中药组和西药组治疗后疗效指数总有效率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两者疗效指数分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论: 1.加减益经汤和雌孕激素疗贯法均能治疗DOR患者，两组综合疗效相当;两种治疗方法均可改善DOR患者的临床症状，降低bFSH及bLH，升高bE2和AMH，增加AFC，还可升高Treg比例及降低Th17比例，升高IL-10，降低IL-17A、TNF-α、IFN-γ，且其中中药组降低Th17、IL-17A、TNF-α、IFN-γ的作用比西药组明显。 2.加减益经汤和雌孕激素疗贯法均可降低各中医症候积分，但在增加月经量及改善月经血质、腰骶酸痛、乳房胀痛方面中药组具有优势，中药组治疗后中医症状总积分明显低于西药组治疗后。 3.加减益经汤可能通过调节Th17/Treg免疫平衡来改善卵巢储备功能;在一定程度上提高患者的生育能力和妊娠率。 第二部分实验研究 目的: (1)探讨Th17/Treg、趋化因子-1/趋化因子受体4(SDF-1/CXCR4)轴在环磷酰胺(CTX)所致的DOR大鼠发病中的作用机制; (2)通过对比西药补佳乐和AMD3100，检测观察加减益经汤对CTX所致DOR大鼠卵巢功能的改善作用及加减益经汤对DOR大鼠Th17/Treg和SDF-1、CXCR4基因及蛋白水平的影响，进一步探索加减益经汤治疗DOR的疗效及可能的作用机制，为临床上加减益经汤治疗DOR提供理论依据。 方法: 选用动情周期正常（动情周期4-5d，连续出现2个动情周期）60只雌性大鼠开展实验。将纳入实验的动物按体重分层随机（随机数字表法）分为①空白对照组、②模型组、③补佳乐组、④加减益经汤组、⑤AMD3100组，每组各12只。空白对照组每天予0.9％生理盐水1ml进行腹腔注射，连续注射15天;其余组第一天予CTX50mg/kg单次腹腔注射，之后每天予CTX8mg/kg腹腔注射连续造模14天，总共15天。于造模第2天开始给药（即腹腔注射CTX8mg/kg的第一天开始同时给药），除⑤组需腹腔注射给药外，其他组灌胃给药，每日1次，连续28天。加减益经汤组给予11.79g生药·kg-1加0.9％生理盐水，调配成10ml·kg-1灌胃给药;补佳乐组按0.09mg·kg-1补佳乐加0.9％生理盐水，调配成10ml·kg-1灌胃给药;AMD3100组按每次腹腔注射剂量为10mg·kg-1的AMD3100（10毫克/千克溶于200μl磷酸盐缓冲盐水中），每周注射3次;空白对照组、模型组、AMD3100组按10ml·kg-1灌胃给蒸馏水。于实验第15天，各组处死处于动情间期的大鼠6只;于实验第29天（及全部用药结束当天）开始，处死各组剩余6只大鼠，腹主动脉采血，采集相关组织。观察大鼠一般情况及动情周期的变化。观察大鼠卵巢指数子宫指数的变化。血清激素检测:以酶联免疫吸附技术(ELISA)测定给药前后各组大鼠血清中LH、FSH、E2、AMH和IL-10、IL-17水平的变化。PCR法检测大鼠卵巢组织中CXCR-4、SDF-1mRNA的表达，Westernblot检测大鼠卵巢组织中CXCR-4、SDF-1蛋白的表达。流式细胞术检测大鼠Th17、Treg比例。 结果: 1.大鼠一般情况观察结果 各组大鼠在实验期间全部存活，空白对照组大鼠外观体征、精神状态、行为活动、呼吸、摄食活动、大小便形状颜色等均正常。各模型组大鼠造模后均出现被毛疏松、精神不振，四肢无力、活动减少、大便溏稀、弓背等，各给药组大鼠在治疗第4周，整体状态与空白对照组大鼠无明显差异。 2.对大鼠动情周期的影响 大鼠给药2周后，与空白对照组比较，模型组周期正常百分比明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，加减益经汤组、补佳乐组周期正常百分比均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，AMD3100组周期正常百分比升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与AMD3100组比较，加减益经汤组、补佳乐组周期正常百分比明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，加减益经汤组与补佳乐组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，加减益经汤组、补佳乐组、AMD3100组周期正常百分比均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 大鼠给药4周后，与空白对照组比较，模型组周期正常百分比有所上升，但差异仍有统计学意义(P＜0.05)，说明模型组大鼠有自我恢复能力，但仍未恢复正常。与模型组比较，加减益经汤组、补佳乐组、AMD3100组周期正常百分比均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与AMD3100组比较，加减益经汤组、补佳乐组差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，加减益经汤组、补佳乐组、AMD3100组周期正常百分比差异均无统计学意义（P＞0.05）。 3.大鼠卵巢指数、子宫指数比较 大鼠给药2周后，与空白对照组比较，模型组卵巢指数、子宫指数均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组卵巢指数、子宫指数均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与AMD3100组比较，加减益经汤组、补佳乐组差异无统计学意义(P＞0.05)，加减益经汤组与补佳乐组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组卵巢指数、子宫指数均下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。 大鼠给药4周后，与空白对照组比较，模型组卵巢指数、子宫指数均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组卵巢指数、子宫指数均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与AMD3100组比较，加减益经汤组、补佳乐组差异无统计学意义(P＞0.05);加减益经汤组与补佳乐组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组卵巢指数、子宫指数差异无统计学意义(P＞0.05);AMD3100组卵巢指数、子宫指数仍降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 4.血清中IL-10、IL-17比较 大鼠给药2周后，与空白对照组比较，模型组IL-10的表达水平降低、IL-17的表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组IL-10的表达水平升高、IL-17的表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组差异无统计学意义(P＞0.05)，AMD3100组与加减益经汤组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组IL-10的表达水平降低、IL-17的表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 大鼠给药4周后，与空白对照组比较，模型组IL-10的表达水平降低、IL-17的表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组IL-10的表达水平升高、IL-17的表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组IL-17的表达水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组IL-10的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）;加减益经汤组与AMD3100组IL-10的表达水平、IL-17的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组IL-10的表达水平、IL-17的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。 5.血清中FSH、LH、E2、AMH比较 大鼠给药2周后，与空白对照组比较，模型组FSH、LH明显升高，E2、AMH水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组FSH、LH水平明显降低，E2、AMH水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与AMD3100组比较，加减益经汤组、补佳乐组FSH、LH明显降低，E2、AMH水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05);加减益经汤组与补佳乐组比较，E2水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05);加减益经汤组与补佳乐组FSH、LH、AMH水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组FSH、LH水平升高，E2、AMH水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 大鼠给药4周后，与空白对照组比较，模型组FSH、LH明显升高，E2、AMH水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组FSH、LH水平明显降低，E2、AMH水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与AMD3100组比较，加减益经汤组、补佳乐组FSH、LH明显降低，E2、AMH水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05);加减益经汤组与补佳乐组比较，E2水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;加减益经汤组与补佳乐组FSH、LH、AMH水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组FSH、LH、E2、AMH差异无统计学意义(P＞0.05)，AMD3100组FSH、LH水平升高，E2、AMH水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 6.大鼠卵巢中CXCR-4、SDF-1mRNA水平比较 大鼠给药2周后，与空白对照组比较，模型组CXCR-4、SDF-1mRNA水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;与加减益经汤组比较，AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA水平显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 大鼠给药4周后，与空白对照组比较，模型组CXCR-4、SDF-1mRNA水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与加减益经汤组比较，AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA水平降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，补佳乐组CXCR-4、SDF-1mRNA升高，差异有统计学意义（P＜0.05）;与空白组比较，加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1mRNA差异无统计学意义(P＞0.05)。 7.大鼠卵巢中CXCR-4、SDF-1蛋白水平比较 大鼠给药2周后，与空白对照组比较，模型组CXCR-4、SDF-1蛋白水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与加减益经汤组比较，AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白水平显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 大鼠给药4周后，与空白对照组比较，模型组CXCR-4、SDF-1蛋白水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与加减益经汤组比较，AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白水平降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组比较，补佳乐组CXCR-4、SDF-1蛋白升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与空白组比较，加减益经汤组、AMD3100组CXCR-4、SDF-1蛋白差异无统计学意义(P＞0.05)。 8.大鼠Th17、Treg比例及Th17/Treg比较 大鼠给药2周后，与空白对照组比较，模型组Th17比例、Th17/Treg比值升高，Treg比例降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组Th17比例、Th17/Treg比值降低，Treg比例升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组Th17比例、Th17/Treg比值降低，Treg比例升高，且差异均有统计学意义(P＜0.05);与AMD3100组比较，加减益经汤组Th17比例、Treg比例、Th17/Treg比值，差异均无统计学意义(P＞0.05)。与空白组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组Th17比例、Th17/Treg比值升高，Treg比例降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 大鼠给药4周后，与空白对照组比较，模型组Th17比例、Th17/Treg比值升高，Treg比例降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，补佳乐组、加减益经汤组、AMD3100组Th17比例、Th17/Treg比值降低，Treg比例升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与补佳乐组比较，加减益经汤组、AMD3100组Th17比例、Th17/Treg比值降低，Treg比例升高，且差异均有统计学意义(P＜0.05);与AMD3100组比较，加减益经汤组Treg比例明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与AMD3100组比较，加减益经汤组Th17比例、Th17/Treg比值明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与空白组比较，补佳乐组Th17比例、Th17/Treg比值升高，Treg比例降低，但差异无统计学意义(P＞0.05);与空白组比较，加减益经汤组、AMD3100组的Th17比例、Th17/Treg比值及Treg比例差异均无统计学意义(P＞0.05)。 结论: 1.CTX可建立卵巢储备功能减退动物模型，可以导致SDF-1/CXCR4上调，破坏Th17/Treg免疫平衡。 2.加减益经汤与补佳乐治疗后均能显著降低DOR模型大鼠CXCR4、SDF-1mRNA及蛋白水平、调节Th17/Treg平衡，降低血清中FSH、LH，IL-17的水平，增加E2、AMH、IL-10的水平，同时提高卵巢指数和子宫指数，进而改善DOR大鼠卵巢功能，但加减益经汤组降低SDF-1和CXCR4的水平、调节Th17/Treg平衡作用明显优于补佳乐组。说明加减益经汤和补佳乐均可以调节免疫失衡，但加减益经汤效果更显著。 3.加减益经汤组与AMD3100组治疗后均能显著降低DOR模型大鼠CXCR4、SDF-1mRNA及蛋白水平、调节Th17/Treg平衡，降低血清中FSH、LH，IL-17的水平，增加E2、AMH、IL-10的水平，进而改善DOR大鼠卵巢功能，但加减益经汤组在降低FSH、LH水平和提高AMH、E2水平方面，明显优于AMD3100组。说明加减益经汤和AMD3100均可以提高卵巢功能，但加减益经汤效果更显著。 4.加减益经汤和AMD3100可能通过阻断SDF-1/CXCR4通路，从而调节Treg/Th17免疫平衡，改善卵巢功能。
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