摘要
目的观察防风乙醇提取物对LPS所致小鼠炎症模型和RAW264.7细胞炎症模型的抗炎作用及其TLR4/NF-κB信号通路机制。 方法①经大孔吸附树脂法分离纯化获得防风乙醇提取物，UPLC-QE/MS对其主要化学成分进行鉴定，HPLC对含量前5位的化学成分进行定量分析。②建立二甲苯致小鼠耳肿胀及冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性升高炎症模型初步观察防风乙醇提取物的抗炎作用。③建立LPS致小鼠急性炎症反应模型，观察防风乙醇提取物的抗炎作用与机制。健康雄性ICR小鼠按体重随机分为空白组、模型组、地塞米松（0.005g?kg-1）组和防风乙醇提取物高、低剂量（0.38g?kg-1、0.19g?kg-1）组。除地塞米松组每两天灌胃给药1次外，其余各组每日灌胃给药1次，连续7d，模型组与空白组给予等容积0.5%(吐温-80+羧甲基纤维素钠)水溶液。末次给药1h后，除空白组外其余各组小鼠腹腔注射LPS（0.015g?kg-1）建立小鼠急性炎症模型，造模后12h小鼠收集肺泡灌洗液（BALF），摘眼球取血分离血清，Griess法、ELISA法检测小鼠BALF及血清中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β含量；剖取小鼠脏器，计算脏器指数；采用苏木素-伊红染色观察小鼠肺组织病理变化；RT-PCR、Westernblotting法分别检测肺组织中TLR4/NF-κB信号通路相关分子的mRNA、蛋白表达水平。④LPS诱导建立RAW264.7细胞炎症模型，观察防风乙醇提取物体外抗炎效应及作用机制。首先，MTT法测定药物对RAW264.7细胞的最大无毒浓度，筛选细胞的造模和给药时间。其次，RAW264.7细胞以1×105个?mL-1接种到24孔板中，接种后的细胞随机分为空白组、模型组(1μg?mL-1LPS)、地塞米松组(5μg?mL-1)、防风乙醇提取物组(20μg?mL-1、4μg?mL-1、0.8μg?mL-1)，造模12h后，加入对应药物作用3h后收集上清液，检测上清液中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β含量；以5×105个?mL-1密度将RAW264.7细胞接种到6孔板中，随机分为空白组、模型组(1μg?mL-1LPS)、溶剂组(0.02%DMSO)、防风乙醇提取物组(20μg?mL-1、4μg?mL-1)，同法造模及加入药物作用3h后收集细胞制备裂解液，RT-PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOSmRNA和TLR4/NF-κB信号通路相关分子mRNA的表达水平，Westernblotting法检测TLR4/NF-κB信号通路相关分子的蛋白表达量。 结果①UPLC-QE/MS结果表明，防风乙醇提取物含量前10位的成分包括3种色原酮类化合物，依次为升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷；7种香豆素类化合物，依次为花椒毒素、补骨脂素、紫花前胡素、东莨菪素、珊瑚菜素、7-去甲基软木花椒素和花椒毒酚。HPLC结果显示，每1g防风乙醇提取物中含有升麻素苷31.96mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷9.71mg、亥茅酚苷3.76mg、补骨脂素2.44mg和花椒毒素1.17mg。②防风乙醇提取物显著降低二甲苯致小鼠耳肿胀及冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性升高；对LPS所致急性炎症模型小鼠脏器指数无明显影响，能显著改善模型小鼠肺组织的病理损伤（P＜0.001），显著降低小鼠BALF中总蛋白含量（P＜0.01或P＜0.001），抑制小鼠血清及BALF中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量的升高（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001）。③防风乙醇提取物显著下调LPS所致急性炎症模型小鼠肺组织中炎症因子iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达水平（P＜0.05或P＜0.001），下调模型小鼠肺组织与TLR4/NF-κB信号通路相关的TLR4、MyD88、TRAF6、RelAmRNA表达水平，及TLR4、MyD88、p-p65/p65的蛋白表达水平（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001），上调IκBα蛋白表达量（P＜0.01或P＜0.001）。④基于LPS所致RAW264.7细胞炎症模型，防风乙醇提取物能显著减少细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001）；显著下调细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOSmRNA表达水平（P＜0.001），及TLR4、MyD88、NF-κB1、TRAF6、RelAmRNA转录水平和TLR4、p65、p-p65、iNOS蛋白表达水平（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001）。 结论防风乙醇提取物具有良好的抗急性炎症作用，作用发挥与抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路激活有关，其中色原酮类和香豆素类化合物可能是其抗炎作用的主要物质基础。研究结果为其“祛风解表”功效与应用提供了药理学依据。
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