摘要
种子作为植物特有的生殖器官，不仅是幼苗生长的营养来源，也是人和动物的食物来源。目前关于植物种子内部结构的研究主要集中在切片等解剖学手段，使用二维切片技术不能获得全面的空间结构信息。而三维重构技术可以捕捉细胞内、组织内发生的小概率事件，分析三维结构的差异，能从组织层面上分析多种特定区域的空间结构差异，深刻理解其发生机理。因此，使用三维重建技术对于研究组织三维结构和细胞空间分布，具有重要意义。 本研究以银杏（Ginkgobiloba）种胚和拟南芥（Arabidopsisthaliana）种子为研究材料，通过使用显微CT(MicroCT,Micro-computedtomography)、LSFM(lightsheetfluorescencemicroscopy)和AutoCUTS-SEM(automaticcollectorofultrathinsectionsscanningelectronmicroscopy)三种三维重构技术，结合ImageJ、CTan、Imaris、MorphoGraphX、Cytoscape等分析软件，对种子的三维结构以及细胞排列等进行了深入探究。主要结果如下： (1)银杏种胚micro-CT三维重构结果显示,与锇酸相比，碘化铯更适合用于银杏显微CT样品的制备。 (2)银杏胚胎孔隙率的研究统计表明，胚胎成熟早期组织的孔隙率最大，胚胎成熟晚期最小。此外，子叶的孔隙率大于胚根组织。 (3)银杏种胚分泌腔在胚胎成熟早期数量最少，体积和表面积也相对较小，而在胚胎成熟晚期分泌腔数量增多，体积和表面积逐渐变大。 (4)以Col-0,Ws和Ler三种拟南芥种子作为研究对象，利用显微CT技术分析，结果显示种子内部包含子叶、下胚轴、种皮、糊粉层等结构。此外，显微CT三维结果显示，Col-0的表面积、体积和孔隙率均最大，Ws的表面积、体积和孔隙率均最小。 (5)拟南芥胚LSFM重构结果及空间拓扑分析显示，Ler生态型的degree(细胞连接度)、closeness(紧密性)、BC(BetweennessCentrality，细胞连接度)与其他两种生态型比相对较大，而eccentricity(偏心率)与其他两种相比较小。Ler的细胞排列最紧密，而其他两种拟南芥种子内部组织排列比较疏松。 (6)使用化学固定和常规块染相结合的方法制备的超薄切片样品，适用于拟南芥超薄连续切片的收集。利用AutoCUTS-SEM技术收集2905张100nm的超薄切片，建立拟南芥胚超薄连续切片库，并对拟南芥胚三维重构，证明该技术适用于体积较大的植物组织样品。 (7)提取每一张超薄连续切片中维管组织的结构，三维重构结果显示，维管组织以分枝状分布在整个拟南芥胚组织中。拟南芥胚细胞超微结构显示，其内部结构轮廓清晰，含有大量丰富的细胞器。 综上所述，本研究展示了这些技术在银杏种胚及分泌腔的三维发育过程，以及从不同尺度探究了拟南芥种子的组织细胞排列的作用，为探究植物种子三维结构及其发育过程提供了技术支持。
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