原花青素通过Wnt/β-catenin信号通路调控Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤及细胞凋亡

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中文摘要：阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是老年人最常见的一种痴呆类型，临床表现为记忆障碍、执行功能障碍以及人格和行为改变等。其病理特征是细胞外β淀粉样斑块沉积形成斑块（senileplaque，SP）、磷酸化tau蛋白（p-tau）升高以及神经元大量丧失。Wnt信号通路是近年来机制研究较为深入的一条通路，在胚胎神经系统的发育中起到了重要的作用，也与成体神经元的增殖、分化、迁移，突触发生以及轴突生长等过程相关。原花青素（proanthocyanidins，PC）是一种植物多酚，具有多种生物活性。本研究观察β-淀粉样肽（β-amyloidpeptide，Aβ）Aβ25-35对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中Aβ沉淀、tau蛋白磷酸化及细胞凋亡（apoptosis）的影响，应用原花青素干预后，观察这些指标的变化，同时检测PC对Aβ25-35作用的细胞中经典Wnt信号通路Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白β-catenin、cyclinD1、糖原合酶激酶-3（glycogensynthasekinase-3，GSK-3）磷酸化片段p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达水平的变化。应用通路激活剂Wnt3a或通路抑制剂Dkk1后检测以上蛋白表达水平，以探索PC对SH-SY5Y细胞Aβ沉淀、tau蛋白磷酸化及细胞凋亡的作用及机制。为控制和预防阿尔茨海默病和扩展原花青素应用范围提供实验依据。本文主要分为两个部分：第一部分PC对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤及细胞凋亡的保护作用研究目的探究PC对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞Aβ1-42生成、tau蛋白磷酸化及细胞凋亡的作用。研究方法 1.设立对照组、不同浓度PC（0.1、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/mL）组，给予不同浓度PC，四甲基偶氮噻唑蓝（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）法检测细胞活力。 2.设立对照组、不同浓度Aβ25-35（1.0、5.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）组，给予不同浓度Aβ25-35，MTT法检测细胞活力，确定构建细胞损伤模型的使用剂量。 3.设立对照组、Aβ25-35（15.0μmol/L）组、不同浓度PC（1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组，PC干预组加入含Aβ25-35培养液预处理2h后，更换含PC的培养液继续培养24h。MTT法检测细胞活力，酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）检测Aβ1-42分泌水平，蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测β-淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（β-siteamyloidprecursorprotein-cleavingenzyme1,BACE1）、tau、p-tau、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteinylaspartatespecificproteinase-3，caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病基因-2（Bcelllymphoma/leukemia-2，Bcl-2）及Bax的蛋白表达水平。研究结果 1.0.1、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/mLPC对细胞活力未见影响（P＞0.05）。 2.15.0、20.0、25.0μmol/LAβ25-35引起细胞活力降低（P＜0.05），后续实验以15.0μmol/LAβ25-35诱导细胞，构建细胞损伤模型。 3.与对照组相比，Aβ25-35（15.0μmol/L）组细胞活力降低（P＜0.05）；与Aβ25-35（15.0μmol/L）组相比，2.5、5.0、7.5、10.0μg/mLPC干预可使细胞活力升高（P＜0.05），改善Aβ25-35引起的细胞活力降低。 4.与对照组相比，Aβ25-35（15.0μmol/L）组细胞p-tau、BACE1、caspase-3蛋白表达水平及Aβ1-42的分泌水平升高，且Bcl-2/Bax降低（P＜0.05）。PC干预可以逆转Aβ25-35对细胞的毒性作用，5.0、7.5μg/mLPC干预可使p-tau及BACE1蛋白表达水平降低（P＜0.05），1.0、2.5、5.0、7.5μg/mLPC干预可使caspase-3蛋白表达水平及Aβ1-42的分泌水平降低，Bcl-2/Bax升高（P＜0.05）。第二部分PC通过Wnt/β-catenin信号通路调控Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤及细胞凋亡研究目的探究PC对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤及细胞凋亡保护作用的机制研究方法 1.设置对照组、Aβ25-35（15.0μmol/L）组、不同浓度PC（1.0、2.5、5.0、7.5μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组，Westernblot检测细胞中β-catenin、cyclinD1、p-GSK-3β（Ser9）及GSK-3β蛋白表达水平； 2.设置对照组、Aβ25-35（15.0μmol/L）组、PC（7.5μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组、Dkk1（100.0ng/mL）组和Dkk1（100.0ng/mL）+PC（7.5μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组。Westernblot检测细胞中BACE1、tau、p-tau、caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin、cyclinD1、p-GSK-3β（Ser9）及GSK-3β蛋白表达水平，ELISA检测Aβ1-42分泌水平。 3.设置对照组、Aβ25-35（15.0μmol/L）组、PC（7.5μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组、Wnt3a（100.0ng/mL）组和Wnt3a（100.0ng/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组。Westernblot检测细胞中BACE1、tau、p-tau、caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin、cyclinD1、p-GSK-3β（Ser9）及GSK-3β蛋白表达水平。研究结果 1.与对照组相比，15.0μmol/LAβ25-35可使细胞中β-catenin、cyclinD1及p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达水平下降（P＜0.05）。 2.与Aβ25-35（15.0μmol/L）组相比，1.0、2.5、5.0、7.5μg/mLPC干预可使Aβ25-35诱导细胞中β-catenin及cyclinD1蛋白表达水平上升（P＜0.05），2.5、5.0、7.5μg/mLPC干预可使p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达水平上升（P＜0.05）。 3.与PC（7.5μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组相比，Dkk1（100.0ng/mL）+PC（7.5μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组细胞β-catenin、cyclinD1和p-GSK-3β（Ser9）蛋白表达水平下降（P＜0.05），p-tau、BACE1和caspase-3蛋白表达水平上升（P＜0.05），Aβ1-42分泌增高（P＜0.05），Bcl-2/Bax降低（P＜0.05）。 4.与Aβ25-35（15.0μmol/L）组相比，Wnt3a（100.0ng/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组和PC（7.5μg/mL）+Aβ25-35（15.0μmol/L）组β-catenin、cyclinD1及p-GSK-3β（Ser9）蛋白的表达水平升高（P＜0.05），p-tau、BACE1和caspase-3蛋白表达水平下降（P＜0.05），Bcl-2/Bax升高（P＜0.05）。研究结论 1.Aβ25-35（15.0、20.0、25.0μmol/L）诱导致细胞活力降低，PC（0.1、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/mL）对细胞活力未产生明显影响。PC（2.5、5.0、7.5、10.0μg/mL）可逆转Aβ25-35引起的细胞活力降低。 2.PC可抑制Aβ25-35诱导细胞Aβ1-42分泌、tau蛋白过度磷酸化以及细胞凋亡。 3.PC可上调Aβ25-35诱导细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、cyclinD1和p-GSK-3β（Ser9）蛋白的表达水平。 4.抑制Wnt/β-catenin信号通路后PC对细胞损伤和细胞凋亡水平的调控作用下降，信号通路相关蛋白β-catenin、cyclinD1和p-GSK-3β（Ser9）蛋白的表达水平下降，PC可能是通过Wnt/β-catenin信号通路调控Aβ25-35诱导的细胞损伤和细胞凋亡。PC与Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a作用相似，PC可能可以正向调节Wnt/β-catenin信号通路发挥对抗Aβ25-35引起的细胞毒性作用。

作者：

李琪

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关键词：

阿尔茨海默病原花青素 Wnt/β-catenin信号通路 tau蛋白过度磷酸化细胞凋亡

授予学位：

硕士

学科专业：

公共卫生

导师：

张小强、宋爱菊

学位年度：

2021

学位授予单位：

东南大学

语种：

中文

中图分类号：

R74