摘要
第一部分血浆甲氧基肾上腺素类物质候选参考方法的建立 目的:在同位素稀释液相色谱串联质谱技术(IsotopeDilutionLiquidchromatographytandemmassspectrometry，ID-LC/MS/MS)的基础上，建立检测血浆甲氧基肾上腺素类物质的候选参考方法。 方法:采用甲氧基肾上腺素类物质同位素标准溶液为内标，重量法进行取样，标准曲线法进行定量。采用AcquityUPLCFLⅠ-ClassSystem超高液相色谱仪(Waters，美国)与API6500plus三重四极杆质谱仪（ABSCIEX，美国）进行液质联用分析，通过优化色谱质谱条件来分离干扰物，采用蛋白沉淀结合固相萃取对样本进行前处理，并对采用的蛋白沉淀剂、淋洗和洗脱溶液进行选择和优化。根据相关EP文件进行方法学评价。 结果:选择甲氧基肾上腺素-D3和甲氧基去甲肾上腺素-D3为同位素标记内标，样本采用蛋白沉淀和弱阳离子交换固相萃取进行前处理。色谱柱采用岛津shim-packPFPP柱（2.1×100mm，1.8μm），流动相A、B分别为含0.1％甲酸和2mmol/L甲酸铵的水溶液，甲醇;采用梯度洗脱，整个分析时长为7min。进样体积、柱温和自动进样器温度分别为20μL，30℃和7℃。采用电喷雾离子源正离子多反应检测模式，甲氧基去甲肾上腺素检测选择m/z180.1→m/z148.2，m/z183.2→m/z151.3为定量离子对，m/z180.1→m/z165.3，m/z183.2→m/z168.3为定性离子对;甲氧基去甲肾上腺素检测选择m/z166.0→m/z134.1，m/z169.1→m/z137.1为定量离子对，m/z166.0→m/z121.1，m/z169.1→m/z124.1为定性离子对。进样量为20μL时，甲氧基肾上腺素的检测限及定量限分别为0.38pg/g、1.55pg/g，甲氧基去甲肾上腺素的检测限及定量限分别为1.08pg/g、3.54pg/g。方法精密度实验中，甲氧基肾上腺素的批内CV为0.66％-1.05％，批总CV为0.71％-1.13％，甲氧基去甲肾上腺素的批内CV为0.43％-1.10％，批总CV为0.61％-1.42％。不同加标浓度的甲氧基肾上腺素加样回收率在98.3～101.7％之间，甲氧基去甲肾上腺素加样回收率在98.5～101.9％之间。测定4种血浆样本中甲氧基肾上腺素的相对扩展不确定度分别为2.56％，2.25％，1.88％，1.89％，甲氧基去甲肾上腺素的相对扩展不确定度分别为3.10％、2.34％、2.16％、1.73％。 结论:本研究建立了基于同位素稀释液相色谱串联质谱技术检测甲氧基肾上腺素类物质的候选方法，方法灵敏、特异、精密、正确，可望作为检测血浆甲氧基肾上腺素类物质的参考方法。 第二部分血浆甲氧基肾上腺素类物质候选参考方法的应用 目的:开展室间质量评价计划，将建立的候选参考方法对室间质量评价计划样本进行定值，评价参加实验室的检测质量和MNs检测标准化现状;制备MNs候选参考物质，为制造商及临床实验室提供参考溯源标准;开展与常规质谱法的比对研究，对常规质谱法进行评价，对制备物的互通性进行评估。 方法:以本方法测定均值为靶值，以30％允许总误差为评价限，对2020年NCCL开展的室间质量评价计划结果进行分析，计算参加实验室的及格率，评估血浆MNs检的标准化现状。根据ISOGuide35:2017与EP30-A，制备低中高三个浓度水平的MNs候选参考物质，以本研究建立的候选参考方法对其定值，评估MNs候选参考物质的均匀性、稳定性和冻融效应。根据EP15-A3对常规质谱法的精密度进行验证。根据EP9-A3，收集初测值浓度为10-1500pg/mL的53例血浆样本用于方法学比对，对常规质谱法检测质量进行评价。采用EP30-A和IFCC互通性评价方案分别对制备物的互通性进行评价。 结果:所有参加实验室检测202013、202014样本MN的及格率分别为89％和93％，NMN的及格率分别为91％和93％。制备的低中高三种浓度水平MNs候选参考物质MN的认定值及不确定度分别为:35.69±1.37pg/g，207.13±5.26pg/g、388.75±8.98pg/g;NMN的认定值及不确定度分别为:74.35±2.16pg/g，296.94±8.05pg/g，618.85±10.89pg/g。三种浓度水平MNs候选参考物质均匀性好，在-20℃条件下6W稳定性良好，无明显冻融效应。四种常规质谱法的精密度均满足要求。方法学比对研究中，对于MN检测，四种常规质谱法与候选参考方法的线性回归方程的斜率范围为0.75～1.03，截距为-9.18～-3.30pg/mL，NMN检测的斜率范围为0.74～1.03，截距为-8.00～13.30pg/mL。四种常规质谱法与候选参考方法测定MN的偏倚范围为-17.28～-2.11pg/mL，相对偏倚为-29.04％～-4.81％。测定NMN的偏倚范围为-68.68～16.80pg/mL，相对偏倚为-29.45％～5.70％。 结论:开展室间质量评价计划是推动标准化进程的有效途径。本研究中研制了低中高三种浓度水平的MNs候选参考物质，可为临床实验室检测MNs提供溯源与量值传递标准，促进MNs检测标准化。
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