摘要
多不饱和脂肪酸(PUFAs)在促进人类健康和降低疾病风险等方面发挥着重要作用，近年来越来越受到人们的关注。由于PUFAs的传统来源——鱼油具有原料难以获得、气味不佳及重金属污染等缺点，海洋微藻与鱼油有相似的营养成分且易于培养，使其逐渐成为了新的生产PUFAs替代品。裂殖壶菌因其具有易于培养、生物量高和脂肪酸含量丰富等特点，目前已被用于PUFAs特别是二十二碳六烯酸(DHA)的商业生产。微藻合成PUFAs的途径主要为脂肪酸合成酶(FAS)途径和聚酮合酶(PKS)途径，裂殖壶菌通常被认为是通过PKS途径合成PUFAs的，但其合成调控机制还需要进一步地解析。为此，本研究以裂殖壶菌为出发菌株，利用异源表达等手段研究PKS基因簇的结构和功能，从代谢和转录水平上进一步探究各结构域调控PUFAs合成的具体机制;结合外源添加浅蓝菌素抑制FAS，通过监测裂殖壶菌中脂肪酸的合成情况进一步解析PUFAs合成的分子机制，并获得通过添加浅蓝菌素使裂殖壶菌高产PUFAs的发酵策略。最后，从代谢水平和肠道微生物菌群的角度探讨了裂殖壶菌在斑马鱼养殖中的抗病营养功能。本研究所获得的重要研究结果和结论如下: (1)首先利用染色体步移技术成功克隆裂殖壶菌PKS基因簇，测序并通过生物信息学分析发现，ORFA序列为6579bp，预测蛋白质大小约为234.92kDa，包含KS、AT、ACPs、KR和DH等结构域;ORFB序列为6093bp，蛋白质大小约为221.23kDa，包含KS、CLF、AT和ER等结构域;ORFC序列为4398bp，蛋白质大小约为161.44kDa，包含两个DH和一个ER结构域。然后，利用重叠延伸PCR和电转化技术，成功在酿酒酵母中表达了ORFA、ORFB和ORFC等基因。脂肪酸组分分析结果表明，三株异源表达菌株的脂肪酸产量比原始菌株都显著提高，尤其是产生了二十碳以上的PUFAs，如DPA、DHA等。尤其在ORFC异源表达菌株中，DHA含量占总油的比值最高，达到11.07％。PKS基因簇在PUFAs合成中具有必不可少的功能，本结果证明了每个ORF单独表达都能诱导PUFAs的合成，尤其是ORFC可能在DHA等PUFAs的合成调控中扮演着更重要的角色。 (2)为进一步探究PKS基因簇中ORFC在脂肪酸合成中的作用，我们分别过表达了裂殖壶菌中ORFC上DH和ER两个结构域。通过脂肪酸组分分析发现，DH过表达菌株中PUFAs的含量较原始菌株增加10.8‰其中DHA含量增加9.8％，EPA含量降低了20.5％;而ER过表达菌株中的PUFAs含量降低16.5％，EPA占总油脂的比值增加了66％，SFAs含量升高了8.9％。代谢组学和转录组学的联合分析表明，DH结构域的过表达增强了磷酸戊糖途径(PPP)和甘油三酯(TAG)的生物合成，减弱了三羧酸(TCA)循环和脂肪酸氧化，从而提高了脂肪酸（尤其是PUFAs）的生物合成;而ER结构域的过表达增强了脂肪酸积累阶段的TCA循环和脂肪酸过氧化。因此，我们认为ORFC上的DH和ER两个结构域在脂肪酸合成中具有不同的功能。DH结构域对于PUFAs(尤其是DHA)的合成至关重要，ER结构域则可能与SFAs的合成相关。 (3)外源添加一种FAS抑制剂——浅蓝菌素来研究其对裂殖壶菌PUFAs合成的影响。脂肪酸组分分析结果表明，浅蓝菌素可以显著提高裂殖壶菌总油脂产量，且在发酵72h后总PUFAs、DPA和DHA的产量分别提高28.5％、36.70％和28.3％，同时PUFAs/SFAs比例从86.73％上升至106.98％，说明浅蓝菌素可以促进裂殖壶菌合成PUFAs。代谢组学分析表明浅蓝菌素通过促进细胞中脂肪酸合成底物——乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A的积累和NADPH的供应，同时增强了裂殖壶菌的抗氧化能力，促进了裂殖壶菌中PUFAs的合成。外源添加浅蓝菌素的裂殖壶菌中PKS基因簇表达水平的上调及FAS途径基因表达水平的下调，表明浅蓝菌素可能通过抑制裂殖壶菌中的FAS途径降低SFAs的产量，促进PKS途径来增加PUFAs的产量。该研究进一步证实了PKS途径为裂殖壶菌合成PUFAs的主要途径，也为获得裂殖壶菌高产PUFAs的发酵策略提供了参考。 (4)为了研究裂殖壶菌干粉对水产动物免疫力的影响，我们设计了以裂殖壶菌干粉作为鱼油替代品来饲养模式动物——斑马鱼的实验，制备了分别添加60和120g/kg裂殖壶菌的饲料。饲养56天后，杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiellapiscicida）的攻毒试验表明，与对照组相比，含有120g/kg裂殖壶菌的饲料显著提高了斑马鱼的成活率(40％)。同时，组织病理学研究显示饲喂高浓度裂殖壶菌的斑马鱼肠壁中的杯状细胞密度最高。体液代谢组学数据分析表明，裂殖壶菌的添加促进了斑马鱼体内的TCA循环、能量供应、牛磺酸代谢和丝氨酸代谢，降低了胆固醇合成代谢。肠道微生物组学分析发现，在喂食添加120g/kg裂殖壶菌饲料的斑马鱼中，益生菌（乳杆菌属、假黄色单胞菌属、丁酸球菌属和Dorea属）的丰度显著提高，而疑似病原菌（黄杆菌属、希瓦氏菌属、假单胞菌属、柠檬酸杆菌属和支原体）的丰度显著降低。Spearman相关性分析进一步发现Dorea属和丁酸球菌属中的一些物种可能具有免疫调节能力。此研究表明，裂殖壶菌可以通过改善免疫相关的新陈代谢和肠道菌群来增强斑马鱼的抗病能力。该项研究为微藻对水生动物抗病能力的影响机制提供了新的见解。
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