摘要
雄性哺乳动物的睾丸组织所需的最适温度比机体核心温度低2～8℃，阴囊的组织结构特点以及睾丸动脉蔓状静脉丛系统都是睾丸的温度调节机制，当温度超出睾丸的温度调节能力范围时，热应激会导致睾丸内的各细胞受到不用程度的损伤，导致雄性不育等生殖功能障碍。因此，探究热应激导致睾丸组织损伤的机制以及寻找有效的方法保护睾丸组织免受热应激的损伤对于解决由热应激所致的生殖功能障碍有重要意义。小热休克蛋白CryAB(αB-crystallin)属于热休克蛋白家族，可由热应激而诱导表达，可以帮助错误折叠的蛋白质复性或者降解。此外，CryAB还参与调控多条细胞信号通路，是机体重要的内源性保护因子。本文以体外培养的TM4睾丸支持细胞和TM3睾丸间质细胞作为热应激研究模型，探讨在热应激与应激后恢复条件下睾丸间质细胞与支持细胞的病理性损伤以及保护性蛋白Hsps的变化规律，探究CryAB提高支持细胞耐热性的分子机制;另外我们通过构建的CryAB基因敲除小鼠来探究CryAB在小鼠体内的保护作用。在此基础上，我们筛选出具有抗热应激作用的药物维生素C，从体内、外验证了其诱导Hsps表达和抗氧化应激损伤作用，并对其保护机制进行了深入研究。 为了研究睾丸支持细胞在热应激下及应激后的病理变化，本研究通过细胞病理学、氧化损伤酶活性、流式细胞、RT-PCR、westernblot和激光共聚焦等技术和方法，对睾丸支持细胞细胞在热应激状态下的病理损伤特点、Hsps的转录和蛋白表达水平的变化、细胞骨架的变化以及Vc对其的保护作用等进行了研究。结果显示，Vc预处理可以有效降低TM4支持细胞系在热应激恢复阶段的细胞凋亡率、MDA水平和LDH活性;然而未经Vc预处理的细胞在恢复阶段其MDA水平和LDH活性会显著升高，并且细胞呈现出空泡变性和核固缩等细胞病理变化。此外，热应激后细胞内热休克蛋白CryAB、Hsp27、Hsp70和Hsp110的转录和翻译水平在恢复3h和12h时显著升高;用Vc预处理还可以缓解细胞在热应激后发生微管聚合和破碎。结果提示Vc预处理可以通过减少氧化应激损伤、诱导热休克蛋白表达以及稳定细胞骨架来保护TM4免受热应激损伤。 本研究通过建立睾丸间质细胞热应激与热应激恢复模型，利用细胞病理学、氧化损伤相关酶活性、组织化学染色、透射电镜观察、RT-PCR和westernblot等检测技术和方法，对睾丸间质细胞在热应激后的病理损伤特点、细胞内HSPs的转录和蛋白表达水平的变化、自噬相关蛋白和线粒体凋亡途径相关蛋白的表达变化、细胞超微结构变化以及Vc的分子保护机制进行了研究。结果显示，Vc预处理后可以有效降低热应激恢复阶段细胞内MDA水平和LDH活性，而对照组细胞的MDA水平和LDH活性在恢复阶段均有升高;在热应激恢复阶段对照组细胞胞质中有大量自噬小体，LC3Ⅱ的蛋白表达与电镜观察结果一致，均发现热应激会导致对照组细胞自噬异常激活;预添加Vc可以诱导热休克蛋白CryAB和Hsp27在应激恢复至12h时高表达，并降低线粒体凋亡途径相关蛋白的表达。试验结果提示Vc预处理可以减少氧化应激损伤、诱导小热休克蛋白表达、抑制线粒体凋亡途径，从而保护TM3间质细胞系免受热应激损伤。 先前研究发现添加Vc均可诱导TM3和TM4细胞中CryAB蛋白的高表达，因此我们推测CryAB蛋白在热应激后发挥了关键的保护作用，因此本研究首先构建稳定过表达CryAB蛋白的TM4支持细胞系，通过对热应激及热应激后恢复条件下细胞自噬相关基因的转录水平检测，细胞凋亡检测，自噬相关蛋白、内质网应激途径相关蛋白以及线粒体凋亡途径相关蛋白的检测，研究CryAB在TM4睾丸支持细系胞受到热应激刺激时所发挥的保护作用及机制。结果发现，CryAB过表达可以显著降低热应激诱导的细胞凋亡;CryAB可以显著降低自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达;过表达CryAB可以通过上调Bcl-2，抑制caspase-12、Bax、Cyto-C和GRP78/Bip蛋白表达，进而降低cleaved-caspase3的表达来发挥抗凋亡作用。 为了进一步探究CryAB的抗热应激分子机制，本研究通过siRNA干扰技术和慢病毒包装技术构建稳定干扰CryAB基因的TM4细胞系，通过对热应激及热应激后恢复条件下细胞自噬相关基因的转录水平和蛋白水平检测，细胞凋亡检测，内质网应激途径相关蛋白和线粒体凋亡途径相关蛋白以及凋亡蛋白的检测，研究干扰CryAB基因转录和蛋白翻译对TM4细胞抗热应激能力的影响。结果发现，干扰TM4细胞内CryAB基因转录和蛋白的翻译表达后，TM4细胞受热应激诱导的凋亡数量显著上升;自噬相关基因转录水平在热应激恢复12h时均有明显上调;αBshRNA组细胞LC3Ⅱ蛋白表达在恢复阶段发生极显著上调;干扰CryAB后，TM4细胞内质网应激和线粒体损伤相较于NCshRNA组更加明显，具体表现为CHOP，GRP78，Bax/Bcl-2和Cyto-C蛋白的表达显著上调，从而导致细胞凋亡相关蛋白caspase12和cleavedcaspase-3蛋白表达增加。试验结果表明，干扰CryAB蛋白表达后，TM4细胞抵抗热应激能力显著降低，导致内质网应激、线粒体损伤严重以及自噬异常，进而导致细胞发生凋亡。 为了明确小热休克蛋白CryAB在小鼠睾丸组织中发挥的保护性作用及机理，本试验在构建全身性CryAB基因敲除小鼠基础上，通过检测血清中睾酮含量、LDH酶活性和ROS含量，以及通过病理组织学和超微结构观察，研究了热应激对野生型小鼠(WT)和基因敲除小鼠(KO)的应激性病理损伤，同时通过转录组学分析方法构建差异基因表达谱，明确差异基因富集的功能分类和富集的信号通路，进一步研究热应激对CryAB敲除小鼠睾丸组织的应激损伤及相关分子机制。研究结果发现，热应激导致WT和KO组小鼠睾酮水平下降，且KO组小鼠下降更加明显;KO组小鼠血清中LDH和ROS含量也显著高于WT组。病理组织学和电镜观察结果发现，热应激诱导KO组小鼠睾丸组织的损伤更加严重。转录组分析发现了383条差异基因，其中GO主要富集到细胞外间隙中;KEGG注释结果表明，差异基因主要与血睾屏障通路与凋亡通路相关基因相关。 为了明确维生素C在睾丸组织中的保护作用以及其与CryAB蛋白的关系，本试验在构建全身性CryAB基因敲除小鼠的基础上，通过检测小鼠血清中睾酮、LDH、MDA和SOD含量以及小鼠睾丸组织的病理组织学和超微结构观察，检测Hsp27、Hsp70和ZO-1蛋白表达水平，研究在热应激条件下Vc对野生型(WT)小鼠和基因敲除(KO)小鼠睾丸组织及血睾屏障的保护作用及分子机制。研究结果显示，添加Vc后，WT和KO组小鼠血清中LDH和MDA水平均有显著下降，SOD酶活性有所上升;睾酮水平极显著上调;添加Vc可以降低热应激对小鼠睾丸组织和血睾屏障的损伤，但KO组小鼠添加Vc后仍显示出比较明显的病理损伤;WT组小鼠在添加Vc后，ZO-1和Hsp27蛋白表达水平显著上调，然而KO组小鼠ZO-1未见明显变化，Hsp27表达发生显著下降。试验结果表明，添加Vc可以显著提高睾丸组织抗氧化能力，减少氧化损伤，并通过诱导Hsp70和Hsp27表达保护睾丸组织和血睾屏障。 综上所述，热应激通过破坏TM3和TM4细胞内氧化还原平衡诱导细胞凋亡;小热休克蛋白CryAB可以通过参与内质网应激途径、线粒体凋亡途径和自噬途径提高TM4支持细胞的耐热性;添加适宜剂量的Vc在体内和体外均可有效保护细胞免受热应激损伤。
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