摘要
乳酸菌细菌素是一类在乳酸菌发酵代谢过程中由核糖体产生的具有抗菌作用的天然蛋白质或多肽类物质，对与产生菌株同源性较近的菌株具有抑制作用，但产生菌株对其自身产生的细菌素具有免疫性。乳酸菌细菌素因具有安全、高效、无污染、无抗药性等优点，受到人们的广泛关注，日益成为许多学者研究的焦点，有望开发成为新型的绿色食品防腐剂或抗菌药物。 目前人们发现的细菌素已超过上百种，但是只有Nisin和其它少数几种细菌素被允许作为食品添加剂使用。然而Nisin只对革兰氏阳性菌起作用，这极大地限制了它的应用。与Nisin相比，部分ClassⅡ类的细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果，其应用潜力巨大，受到国内外许多研究学者的青睐。 本研究对象为ClassⅡb细菌素PlnJK(单肽为PlnJ和PlnK)。ClassⅡb细菌素PlnJK在单肽PlnJ和PlnK以等摩尔浓度混合时，其抑菌效果最强。本研究利用食品级乳酸乳球菌高效表达系统NICE，以分泌型表达载体pNZ8124分泌表达PlnJ和PlnK，并通过一系列分离纯化制备高纯度的PlnJ和PlnK，研究其抑菌活性和抑菌机制，为ClassⅡb细菌素PlnJK在食品及其它领域中的应用提供理论基础。具体研究结果概括如下: 1、plnJ和plnK的基因克隆与表达。根据本实验室分离得到的植物乳杆菌ZJ316中plnJ和plnK的基因序列，在其序列两端分别添加EcoRV和NcoⅠ两个酶切位点，构建重组表达质粒pNZ8124-plnJ和pNZ8124-pinK，并利用电击转化法转化至乳酸乳球菌表达菌株LactococcuslactisNZ9000。经Nisin诱导后，Tricine-SDS-PAGE验证表明:Nisin能够诱导重组蛋白pNZ8124-PlnJ和pNZ8124-PlnK的表达。 2、重组蛋白pNZ8124-PlnJ和pNZ8124-PlnK诱导条件优化。从诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间三个方面对重组蛋白在NICE中的诱导条件进行优化，确定最佳诱导条件为:重组蛋白pNZ8124-PlnJ最佳诱导温度30℃，Nisin浓度1ng/mL，诱导时间6h;重组蛋白pNZ8124-PlnK最佳诱导温度30℃，Nisin浓度5ng/mL，诱导时间6h。 3、PlnJ和PlnK的分离纯化。根据重组蛋白pNZ8124-PlnJ和pNZ8124-PlnK的特性，确定了一系列的分离纯化方法:(1)利用XAD-2大孔树脂，对蛋白发酵上清液进行初步纯化，同时收集有活性的75％甲醇的洗脱液，确定洗脱液中有重组蛋白的存在;(2)利用SP强阳离子柱，对重组蛋白进一步进行纯化，并通过超滤离心管对洗脱液脱盐浓缩;(3)利用制备型高效液相色谱（HPLC）对重组蛋白进行高度纯化，并通过分析型HPLC对分离得到的蛋白PlnJ和PlnK进行纯度分析，得到纯度均在98％以上的蛋白样品。利用BCA法测定蛋白PlnJ和PlnK的浓度，分别为2.215mg/mL和2.855mg/mL。 4、PlnJ、PlnK和PlnJK抑菌活性研究和抑菌机制初探。结果表明细菌素PlnJ、PlnK和PlnJK抑菌谱较广，不仅对柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特菌等革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，对沙门氏菌、副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有较好的抑制效果。细菌素PlnJ、PlnK和PlnJK对沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)，分别为3.2μM、12.8μM和1.6μM。结果表明PlnJK的抑菌活性明显高于单肽PlnJ或PlnK，说明单肽PlnJ和PlnK起协同作用。荧光泄露试验结果表明细菌素PlnJK的抑菌方式可能是造成靶细胞膜的破裂，使得胞内内容物流出，最终导致靶细胞的死亡。
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