摘要
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种具有高度接触性的传染病，给全球养猪业带来了严重的经济损失，其唯一的天然宿主是家猪和野猪。不同CSFV毒株的毒力各不相同，但都会给养猪业造成重大危害，因此寻找新的行之有效的抗病毒策略为当务之急。研究表明胆固醇和脂肪酸的稳态对于病毒的复制至关重要，而病毒可以利用宿主细胞的脂质代谢创造有利繁殖的环境，所以对胆固醇和脂肪酸的研究可以为抗病毒治疗提供新的思路。本研究利用胆固醇转运抑制剂U18666A干扰细胞内胆固醇转运，引起溶酶体内胆固醇聚积，从而有效抑制了CSFV膜融合过程。其次，通过激光共聚焦和免疫共沉淀实验证明了脂肪酸合成酶与CSFV的非结构蛋白NS4B相互作用，调控CSFV的复制。具体研究内容如下: 1U18666A干扰膜融合的过程抑制猪瘟病毒的增殖 首先，使用不同浓度的U18666A处理接种CSFV的PK-15细胞，在12h和24h收样，通过Westernblot和激光共聚焦鉴定病毒蛋白的表达水平，RT-qPCR定量检测病毒核酸的拷贝数，结果显示U18666A破坏细胞内胆固醇运输，导致CSFV的复制受到影响，存在时间和浓度依赖性。其次，在CSFV感染的不同时间点添加U18666A，RT-qPCR检测发现U18666A影响病毒生命周期中的膜融合和复制阶段，但不影响其吸附和入侵。最后，激光共聚焦观察U18666A处理后对CSFV、胆固醇和溶酶体三者的影响。结果显示:U18666A处理导致细胞内胆固醇在溶酶体内蓄积，引起其功能丧失，CSFV不能进行膜融合。本实验证明了U18666A可以有效抑制CSFV复制，是抗瘟病毒治疗的潜在候选药物。 2胆固醇转运蛋白(NPC1)调控猪瘟病毒的复制 为了研究胆固醇转运蛋白(NPC1)在CSFV复制中的作用，本实验将靶向NPC1的siRNA转染到PK-15细胞中，并接种CSFV，通过Westernblot和RT-qPCR验证敲除效率，并观察敲除后对胆固醇转运、溶酶体含量和病毒复制的影响。其次，类似于U18666A的处理方式，验证了丙咪嗪（一种类似于U18666A的阳离子疏水胺）的抗病毒效果。最后，添加Vorinostat到U18666A处理过的PK-15细胞中，接种CSFV，激光共聚焦观察对病毒复制的影响。结果显示:PK-15细胞经U18666A处理后，细胞内胆固醇在溶酶体中蓄积并抑制CSFV复制;丙咪嗪也通过相似的机制抑制CSFV在细胞内的复制。重要的发现是，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)Vorinostat逆转U18666A的抗病毒作用，这表明HDACi逆转了NPC1的功能障碍，细胞内胆固醇蓄积消失，CSFV复制得以恢复。以上研究证明NPC1蛋白对于CSFV复制至关重要。 3脂肪酸合成酶促进猪瘟病毒增殖的机制研究 为了研究脂肪酸合成酶(FASN)在CSFV感染PK-15细胞中的作用，使用小分子抑制剂抑制脂肪酸合成并观察病毒的复制。首先分别使用C75和TOFA或联合使用处理PK-15细胞，另外，分别添加棕榈酸和丙二酰辅酶A到C75/TOFA处理过的细胞，接种CSFV，RT-qPCR定量检测病毒的拷贝数。其次，在不同时间点添加C75，接种CSFV，通过RT-qPCR检测C75对CSFV生命周期的影响。然后，转染CSFV非结构蛋白质粒，通过激光共聚焦和免疫共沉淀鉴定与FASN发生互作的病毒蛋白。最后，接种CSFV，激光共聚焦观察CSFVdsRNA与FASN的共定位关系。结果表明:C75和TOFA通过干扰脂肪酸代谢合成，有效抑制病毒增殖，具有协同作用。而添加丙二酰辅酶A和棕榈酸，可完全恢复抑制作用。C75影响CSFV生命周期中的复制和释放阶段，但不影响其吸附和入侵。激光共聚焦和免疫共沉淀证明FASN能够与CSFV-NS4B互作，在内质网上促进病毒的生物合成。以上研究表明FASN对CSFV复制起正调控作用，研究结果为寻找新的抗病毒靶点提供借鉴意义。
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