摘要
栽培草莓(Fragaria×ananassaDuch.)含有过敏原蛋白Fraa1，特定群体的人可能会出现过敏反应;Fraa1属于PR-10家族，在植物生长过程可能发挥一定的生物功能。‘红颊’草莓(Fragaria×ananassa’Benihoppe’)具产量高、风味佳、果实大、商品性好等特点，目前是国内主栽品种之一。本文以‘红颊’草莓为材料，克隆Fraa1家族中主要的3个基因Fraa1.01、Fraa1.02和Fraa1.03，并对其表达特性进行分析;并构建Fraa1-GFP-pCAMBIA1302融合表达载体和pCAMBIA1301-35SN-Fraa1植物过表达载体转化烟草，对该基因的功能进行了探究。主要结果如下: 1.根据NCBI数据库中已经公布的Fraa1.01、Fraa1.02和Fraa1.03基因序列设计特异引物，以‘红颊’草莓叶片DNA和cDNA为模板，从中克隆了Fraa1.01、Fraa1.02和Fraa1.03基因。其中Fraa1.01基因DNA序列全长为594bp、591bp、584bp，cDNA的全编码区序列为483bp和480bp，编码160和159个氨基酸，中间含有一个长度为101或111bp的内含子;Fraa1.02基因无内含子，DNA和cDNA的序列为483bp，编码160个氨基酸;Fraa1.03基因DNA序列全长为599bp，cDNA的全编码区序列为480bp，中间含有一个119bp的内含子，编码159个氨基酸。3个基因预测蛋白的分子量分别为17766.13Da、17484.82Da和17448.85Da，等电点分别为6.13、5.24、5.64，均无跨膜结构域和信号肽。 2.通过荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了Fraa1基因的组织特异性及其在SA、CEPA、MeJA和草莓炭疽病（ColletotrichumfragariaeBrooks）处理下的表达情况。实验结果表明:Fraa1.01主要在根、茎、叶中表达，在根中表达量最高;Fraa1.02在根、花、花托和瘦果中表达量都很高，其中花托中表达量最高;Eraa1.03主要在根和瘦果中表达，在根中表达量最高。SA在叶中诱导Eraa1.01的表达，在根和茎未能诱导其表达;CEPA仅在叶中诱导Fraa1.01的表达，在根和茎中诱导效果不明显;MeJA在根中诱导Fraa1.01的表达，在茎和叶中诱导效果不明显。SA在根和叶中均诱导Fraa1.02的表达，在茎中未诱导其表达;CEPA和MeJA在根、茎、叶中均诱导Fraa1.02的表达。SA在根和叶中诱导Fraa1.03的表达，在茎中未能诱导其表达;CEPA在茎和叶中诱导Fraa1.03的表达，在根中略微诱导其表达;MeJA在根、茎、叶中略微诱导Fraa1.03的表达。草莓炭疽病诱导Fraa1.01和Fraa1.03的表达，未能诱导Fraa1.02的表达。 3.将Fraa1.01、Fraa1.02和Fraa1.03基因编码区与绿色荧光蛋白(GFP)基因5''端相连，并利用同源重组技术构建了35S:Fraa1-GFPpCAMBIA1302融合表达载体，利用注射法在本氏烟草（Nicotianabenthamiana）瞬时表达Fraa1.01、Fraa1.02和Eraa1.03，结果是Fraa1.01、Fraa1.02和Fraa1.03均定位于细胞核和细胞膜。 4.构建了pCAMBIA1301-35SN-Fraa1植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化K326烟草（NicotianatabacumL.cv.''K326''），通过GUS、PCR和RT-PCR逐步确认转基因事件，并对其转基因株系进行了抗盐性和抗渗透胁迫分析，同时利用RTqPCR技术分析了转基因烟草株系中病程相关蛋白、抗渗透胁迫以及抗氧化相关基因的表达情况。结果表明:转基因烟草株系T0代中NtPR1、NtPR3、NtPR3和NtPR5基因的表达上调，转基因烟草株系T0代中抗氧化胁迫相关基因(NtSOD、NtPPO、NtAPX、NtPAL、NtRbohD和NtCAT)和抗渗透胁迫相关基因NtSPS、NtSAM1的表达亦上调;转基因烟草株系T1代植株在种子发芽期表现出一定的耐盐能力和抗渗透胁迫能力，其中转Fraa1.02基因株系较转Fraa1.01和Fraa1.03株系具有更强的抗逆性。
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