摘要
由于抗生素的不规范使用和滥用，细菌耐药问题日益突出，特别是多重耐药和泛耐药菌株的出现给人类、动物和环境带来严峻挑战，使细菌耐药成为全球日益严重的公共卫生问题。在革兰氏阴性菌引起的感染中，由耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌引发的临床院内感染日趋严重，对人类健康造成严重威胁。肺炎克雷伯菌（Kp）是仅次于大肠杆菌的条件致病菌，属于肠杆菌科克雷伯杆菌属，在我国其主要流行序列型为ST11型。当机体免疫力下降或菌群失调时，可导致患者发生下呼吸系统、泌尿系统及皮肤软组织等社区获得性感染和医院获得性感染。 多粘菌素是临床用于治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线，该类抗生素主要与细菌外膜上的脂多糖结合使细菌外膜膨胀而死亡。研究已表明，革兰氏阴性菌可通过基因组突变或质粒介导的基因水平转移，将带正电荷的L-Ara4N基团或磷酸乙醇胺基团(PEtN)添加到脂多糖进行修饰，从而使细菌对多粘菌素获得不同程度的耐药。随着多粘菌素在养殖业及临床上的应用，多粘菌素耐药局面日益严峻，其中质粒介导的mcr-1耐药基因可在动物、食品、水环境和健康人群中广泛传播，且在我国健康人群肠道菌中mcr-1基因的平均检出率已高达15％。然而，耐药突变的积累是把双刃剑，在使细菌获得耐药性的同时也可能导致其生物学表型、生长速率及致病性等方面发生变化，即产生适应性代价。但病原细菌获得多粘菌素耐药性后的适应性代价报道比较少，研究多粘菌素耐药菌的适应性代价有助于深刻理解耐药菌的潜在弱点，为控制多粘菌素耐药病原菌传播及临床耐药菌感染的治疗提供新的途径。 噬菌体由于具有增殖快、宿主特异性强、可调控宿主微生态、研究历史悠久等优点，使得科学家们重新审视和评估噬菌体在治疗耐药菌感染方面的潜力。本研究首先以32株临床肺炎克雷伯菌分离株为宿主菌，从生活污水中分离得到一株长尾噬菌体NJS1(ΦNJS1)，基因组全长49，292bp(MH445453)，属于Tunavirinae科Webervirus属。一步生长曲线显示其潜伏期约10min，裂解量约75PFU/cell，可特异性感染46.88％(15/32)的临床肺炎克雷伯菌。之后，通过细菌接合方式将携带mcr-1基因的多粘菌素耐药质粒pHNSHP45导入临床分离株A2312NM(ST11)，比较ΦNJS1对多粘菌素敏感型Kp(colistinSKp)A2312NM和多粘菌素耐药型Kp(colistinRKp)A2312NM(mcr-1)的吸附和裂解能力，发现A2312NM(mcr-1)与野生型A2312NM相比更容易被ΦNJS1吸附和感染。当敲除质粒上的多粘菌素耐药基因mcr-1得到A2312NM(△mcr-1)，发现该缺失株对ΦNJS1的敏感性与野生型一致，回补该基因后对ΦNJS1的敏感性又增强至原始质粒水平，从而证实colistinRKp对噬菌体敏感性增强是由于pHNSHP45质粒上的mcr-1基因所致。但是，肺炎克雷伯菌还可以通过基因组突变获得多粘菌素耐药性，主要发生在调控基因mgrB上，该基因主要通过介导PhoPQ和PmrAB二元调控系统使肺炎克雷伯菌获得多粘菌素耐药性。本研究随机筛选得到A2312NM菌株的12株基因组突变株，其中7株发生在mgrB上，对其中两株mgrB突变株和3株非mgrB突变株进行噬菌体吸附和感染实验，同样发现上述这种由于多粘菌素耐药性差异造成对噬菌体敏感性不同的现象。 为研究其他分型肺炎克雷伯菌是否有此适应性代价，随机检测了ΦNJS1对不同MLST型(ST11，ST37，ST65，新ST型)的临床Kp菌株及pHNSHP45质粒携带株Kp(mcr-1)的吸附和裂解能力，发现不同多序列位点分型的Kp在获得多粘菌素耐药性后，都可以表现出对ΦNJS1更敏感的特征。在后续分离的10株裂解肺炎克雷伯菌噬菌体中，有7株都表现出对Kp(mcr-1)更强的感染能力，其中4株噬菌体(NSJ2，NSJ3，NJR15，TAH8)全基因组测序结果显示为长尾噬菌体Tunavirinae科Webervirus属。这一结果表明，多粘菌素耐药Kp对噬菌体敏感性增强的适应性代价存在于多种肺炎克雷伯菌噬菌体中。此外，多粘菌素耐药大肠杆菌MG1655(mcr-1)与对照株相比也表现出对肌尾噬菌体P1vir更强的敏感性，提示这种适应性代价也存在于其他肠杆菌中。 噬菌体往往依赖于宿主菌表面的特异性受体进行吸附，而吸附过程也是噬菌体识别敏感性宿主的关键一步，它影响了噬菌体感染宿主的范围。本研究发现，这些噬菌体只感染非黏液型肺炎克雷伯菌，当黏液型菌株的荚膜多糖合成基因wza缺失后可以被ΦNJS1感染，表明荚膜多糖可能阻碍了ΦNJS1吸附宿主细胞膜表面的受体。用高碘酸盐和乙酸-乙酸盐缓冲液处理细菌后，ΦNJS1吸附宿主菌的能力显著下降，表明非黏液型宿主菌细胞膜表面的多糖结构参与噬菌体吸附过程。通过筛选转座子文库发现，脂多糖合成相关基因wecA、wecG和wzyE影响噬菌体感染效率，表明具有一定三糖重复单元数目的O-抗原长链可帮助细菌抵御噬菌体感染。外膜蛋白BtuB、FepA和TIGR02099家族膜蛋白影响噬菌体感染过程，但它们的缺失并不能使肺炎克雷伯菌完全产生噬菌体抗性，推测ΦNJS1很可能以宿主菌细胞膜表面的数个蛋白为吸附受体。进一步的噬菌体吸附与解离实验表明，多粘菌素耐药病原菌更容易被噬菌体吸附是由于噬菌体可逆吸附水平增强所致。测定ΦNJS1的等电点为2.5左右，基因组突变株和质粒介导的colistinRKp的表面Zeta电位均显著高于野生型及mcr-1缺失株，因此推测由于多粘菌素耐药菌株正电荷基团对脂多糖的修饰使细菌表面净负电荷水平减少，与带负电荷的噬菌体之间的静电排斥力减弱，从而促进多粘菌素耐药细菌与噬菌体之间的有效碰撞率，增强噬菌体可逆吸附水平，进而使多粘菌素耐药株表现出对噬菌体感染更敏感的适应性代价。 为评估这种适应性代价在临床中的应用潜力，进行了生物膜裂解、大蜡螟模型和成年鼠肠道定植模型研究。肺炎克雷伯菌具有极强的生物膜形成能力，而生物膜的形成与其致病性和耐药性密切相关，使感染呈现交替发作、难根治等特点。本研究发现，有无多粘菌素耐药性对肺炎克雷伯菌A2312NM的生物膜形成能力无影响，但经噬菌体处理后，具有多粘菌素耐药性的肺炎克雷伯菌生物膜比野生型更容易被噬菌体裂解。应用大蜡螟模型进行毒力评估，表明colistinRKp感染组大蜡螟死亡率显著高于对照组，提示非黏液ST11型肺炎克雷伯菌A2312NM在获得多粘菌素耐药性后毒力增强。噬菌体处理已感染肺炎克雷伯菌的大蜡螟发现，不论是感染后立即处理还是延后处理，感染colistinRKp大蜡螟具有更高的存活率，提示噬菌体治疗在colistinRKp感染中具有显著优势。通过成年鼠肠道竞争定植模型和单独定植模型进行比较研究，发现colistinRKp也在体内更容易被噬菌体感染，且噬菌体可显著降低体内colistinRKp对多粘菌素B的耐药性水平，提示噬菌体可与抗生素联合使用治疗临床泛耐药性病原菌感染，降低抗生素使用量。多粘菌素耐药性菌株对噬菌体感染敏感性增强的这种适应性代价，为控制当前多粘菌素耐药病原菌传播与临床感染治疗提供了新的途径。
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