摘要
茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是我国主要的经济作物之一，茶树品种作为基本的农业生产资料，是影响茶叶生产经济效益的重要因素，因此品种的选育始终是育种工作的重点。但是茶树中存在自交不亲和、杂交结实率低和远缘杂交不亲和等问题，从一定程度上限制了新品种的培育和种质资源的创新。所以，探究茶树的不亲和反应机制十分必要。虽然目前已有许多关于茶树自交不亲和机制的研究报道，但不亲和反应的机制仍不清楚。本课题组前期对自花和异花授粉后雌蕊样品进行转录组测序，分析筛选获得自花和异花授粉后差异表达基因CsMCU2、CsUGT74B1和CsLecRK3。 本研究中，以茶树品种‘福鼎大白茶’、‘大红袍’、‘紫阳’、‘白毛1号’和‘肉桂’为材料，观察自花和异花授粉后花柱中花粉管的生长情况，并检测不同授粉处理后花柱和子房内源激素含量和雌蕊保护酶活性的变化，分析其生理水平差异;同时，克隆茶树CsMCU2、CsUGT74B1和CsLecRK3基因，分析其序列特征及其在不同茶树组织和不同授粉处理后的表达模式，探讨其与不亲和反应的关系。主要研究结果如下: 1.‘福鼎大白茶’、‘大红袍’、‘紫阳’和‘白毛1号’进行自花授粉处理，再以‘肉桂’为父本对上述品种进行异花授粉处理，样品经苯胺蓝染色后用荧光显微镜观察花粉萌发和花柱中花粉管的生长情况。结果表明:自花和异花授粉后花粉的萌发无明显差异，在授粉后48h花粉管均均可到达花柱基部，但花粉管的生长速度在不同的品种中存在一定差异。设置自交、正交和反交三种授粉处理（‘福鼎大白茶♀×福鼎大白茶♂’、‘福鼎大白茶♀×肉桂♂’和‘肉桂♀×福鼎大白茶♂’），分别利用LC-MS和酶标仪检测三种授粉处理后花柱和子房内源激素(IAA和ABA)含量与雌蕊保护性酶活性的变化。结果表明:三种授粉处理后的花柱和子房内源激素(IAA和ABA)水平以及雌蕊保护酶活性呈现出不同的动态变化模式，表明不同授粉处理后的生理响应机制具有差异，进一步说明茶树授粉后的不亲和反应可能有着不同的调控机制。 2.利用PCR技术克隆了茶树CsMCU2、CsUGT74B1和CsLecRK3基因的开放阋读框(ORF)，通过生物信息学分析其序列特征;利用qRT-PCR分析这三个基因在不同茶树组织和不同授粉处理（自交和异交）雌蕊中的表达情况。结果显示:CsMCU2的ORF为1137bp，编码378个氨基酸，是亲水不稳定蛋白，属于MCU基因家族;CsUGT74B1的ORF为1416bp，编码471个氨基酸，是亲水稳定蛋白，属于糖基转移酶家族;CsLecRK3的ORF为2397bp，编码798个氨基酸是亲水稳定蛋白，属于G类凝集素类受体蛋白激酶家族。组织表达分析结果表明这三个基因在茶树组织中的表达具有时空特异性:CsMCU2在花粉和花粉管中表达量最高，CsUGT74B1在花蕾和雄蕊中表达量最高，CsLecRK3只在授粉后雌蕊中特异表达。在不同品种自花和异花授粉后的雌蕊中，这三个基因的响应模式存在一定差异，多数在授粉后24h表达水平有明显上升，在48h均达到最大值，与未授粉时相比呈显著差异，且在自交和异交48h雌蕊中的表达水平存在明显差异。综上所述，这三个基因以不同的方式参与调控茶树自花和异花授粉后的反应过程，可能是茶树不亲和反应的相关基因，授粉后24和48h可能是涉及不亲和反应的关键时期。
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