摘要
棉花是重要的经济作物，盐胁迫严重影响棉花的生长发育、产量及纤维品质，因此选育耐盐碱棉花新品种是提高棉花产量、改善品质的重要途径。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是一类金属结合抗氧化酶，参与植物对非生物逆境的响应，能够减缓逆境胁迫对植株造成的危害。通过对棉花SOD进行研究为棉花的抗逆育种提供新的方向和思路，具有重大意义。 本研究主要是在实验室前期研究的基础上，通过克隆得到一个棉花编码铜锌超氧化物歧化酶基因Cu/Zn-SOD-3，并对该基因进行表达特点以及功能分析。 1.以陆地棉品种SF06真叶为材料，经过盐胁迫处理后提取棉花总RNA，转录成cDNA，并以获得的cDNA序列为模板，利用PCR扩增技术，克隆了棉花编码基因Cu/Zn-SOD-3并命名为GhCSD3（SequenceID：A13G0817）。该基因cDNA序列长度为893bp,包含5个外显子，4个内含子，一个459bp的开放阅读框：起始于178位、终止于636位。该ORF编码152个氨基酸，编码的Cu/Zn-SOD蛋白质的分子量为15.11kDa,等电点为5.92，亚细胞定位位于细胞质中。 2.利用荧光定量技术分析GhCSD3基因表达特性，发现GhCSD3基因在根中优势表达，其次为成熟叶片。GhCSD3基因受干旱胁迫和盐胁迫诱导表达，并表现出上调表达趋势，推测该基因正调控干旱、盐胁迫。 3.以pCAMBIA1300-eGFP为基础表达载体，构建了GhCSD3基因过表达载体pCAMBIA1300-GhCSD3，采用蘸花法，将携带有目的基因的重组质粒转入拟南芥中，获得过表达铜锌超氧化物歧化酶基因的转基因拟南芥。在盐和干旱胁迫下，测定转基因植株种子萌发率以及根长，结果发现GhCSD3基因的过表达增强了拟南芥对盐、干旱胁迫的抗性,初步证明GhCSD3基因可以提高拟南芥的抗旱、耐盐能力。 4.利用相同的过表达载体，采用蘸花法将重组质粒转入同源基因AtCSD1的拟南芥突变体植株中，获得过表达GhCSD3转基因突变体植株。盐和干旱胁迫下的表型鉴定表明，过表达该基因可以恢复突变体植株的正常生长表型，使其与野生型表型相一致。 5.采用烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRV），利用病毒介导的基因沉默（virus-inducedgenesilencing，VIGS）技术，成功建立了陆地棉中GhCSD3基因的TRV-GhCSD3沉默体系。通过qRT-PCR技术检测沉默前后棉花叶片中GhCSD3基因表达量的变化。结果表明沉默后相对表达量仅为对照组（空载体TRV:00）表达量的57．7%（P＜0.05）。同时对沉默前后棉花叶片中的SOD酶活性测定，发现SOD酶活显著下降，证明沉默该基因后，棉花SOD基因的表达受到抑制。干旱、盐胁迫处理后，GhCSD3基因沉默植株的抗旱、耐盐性明显低于对照植株，由此判断降低GhCSD3基因的表达使棉花对干旱、盐胁迫更敏感。
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