摘要
我国是猪肉生产和消费大国，猪业生产对我国人民肉食消费和养殖业产业结构有重要影响。脂质沉积是人们在猪肉生产过程中关注的热点问题之一，猪肉肉品质、生产效率与经济效益在很大程度上取决于脂质产生和沉积代谢的过程。在过去的几十年中，追求猪的瘦肉率一直是持续改善猪肉生产的主要目标，因此现在猪肉中的脂肪含量越来越低，导致猪肉比较“干”和“柴”，而合理的脂肪沉积可以显著改善猪肉品质和口感风味。脂肪的形成在很大程度上取决于前体脂肪细胞的增殖、分化和生长肥大的过程。因此本研究利用本课题组他人通过全转录组测序筛选出的不同脂肪含量组中差异表达的TULP3基因，首先检测了TULP3基因在不同脂肪含量的莱芜猪背最长肌中的表达水平，之后以3T3-L1前体脂肪细胞作为研究对象，探究了TULP3基因在前体脂肪细胞增殖、分化过程中的作用，探讨了TULP3基因通过影响Hedgehog信号通路进而影响前体脂肪细胞分化的作用机制。具体内容与主要试验结果如下： （1）本试验检测了4头高脂肪含量与4头低脂肪含量的莱芜猪背最长肌组织中甘油三酯和相关基因的表达。结果显示，在高脂肪组中甘油三酯的含量和成脂分化标志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达量均显著高于低脂肪组（P＜0.05），并且验证了TULP3的表达量在高脂肪组中显著高于低脂肪组（P＜0.05）。在前体脂肪细胞体外分化过程中，TULP3的表达量逐渐上升，并在第8天达到最高峰。 （2）构建TULP3过表达载体和合成siRNA并转染至前体脂肪细胞中，CCK-8试验结果显示，过表达TULP3可以促进细胞的增殖活性（P＜0.05）；流式细胞术结果显示，过表达TULP3通过增加S期细胞比例（P＜0.001），而干扰TULP3则使细胞更多的阻滞在G0/G1期（P＜0.001），说明TULP3基因可以促进前体脂肪细胞增殖。 （3）在细胞分化至第8天时，RT-qPCR与WB结果显示，过表达TULP3能显著增加PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达量（P＜0.05），通过油红染色发现过表达TULP3的脂滴密度高于对照组；而与对照组相比，干扰TULP3的表达则显著下调了PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达量（P＜0.05），同时也降低了脂滴密度。 （4）在细胞诱导分化第8天时，过表达TULP3可以抑制前体脂肪细胞中Hedgehog信号通路的标志基因Gli的表达（P＜0.05），而干扰TULP3则可以激活Hedgehog信号通路。在细胞成脂分化过程中添加Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺（Cyclopamin，Cy），细胞中PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达量显著升高（P＜0.05）；而添加Hedgehog信号通路激活剂吗啡胺（Purmorphamine，Pu），则显著降低了细胞中PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达量（P＜0.05）。油红染色结果显示，与对照组相比，抑制Hedgehog信号通路增加了细胞中脂滴数目，而激活Hedgehog信号通路则降低了脂滴数目。 （5）为了进一步探究TULP3促进细胞成脂分化的机制，在抑制Hedgehog信号通路的同时，转染TULP3过表达载体与siRNA。在前体脂肪细胞分化第8天时，CY+pcDNA3.1-TULP3组的PPARγ、FABP4和C/EBPα的表达量显著高于NC+pcDNA3.1-TULP3组（P＜0.05）；而NC+pcDNA3.1-TULP3组的PPARγ、FABP4和C/EBPα的表达量与CY+pcDNA3.1组无显著差异。CY+si-TULP3组的PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达量显著高于NC+si-TULP3组（P＜0.05）；NC+si-NC组的PPARγ、FABP4、C/EBPα的表达量与CY+si-TULP3组无显著差异。 综上所述，本研究验证了TULP3基因在莱芜猪背最长肌高脂肪含量组中有更高的表达；之后以3T3-L1前体脂肪细胞作为研究对象，发现TULP3基因可以促进前体脂肪细胞增殖，并促进前体脂肪细胞成脂分化；进一步研究证明TULP3通过抑制Hedgehog信号通路的活性促进前体脂肪细胞的成脂分化。上述研究结果为进一步研究TULP3基因调控脂肪形成的分子机制提供理论基础。
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