摘要
目的: 研究补骨脂提取物对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的保护作用及作用机制，以及补骨脂中主要植物雌激素类成分补骨脂素对Aβ损伤PC12细胞的保护作用及作用机制，为补骨脂预防与治疗阿尔茨海默病提供实验依据。 方法: 1.动物实验 1.1将3月龄的APP/PS1小鼠60只随机分为4组:模型组、西药阳性对照组（盐酸多奈哌齐0.65mg/Kg·d）、中药阳性对照组（抗脑衰胶囊585mg/Kg·d）、补骨脂提取物组（补骨脂提取物0.5g/Kg·d），另取同月龄C57BL/6小鼠15只作为空白对照组，空白组及模型组给予双蒸水，每日一次，连续灌胃三个月。 1.2采用新物体识别实验、水迷宫实验、避暗实验观察小鼠的学习记忆及判断能力，HE染色、电镜方法观察小鼠海马及下丘脑区的病理改变，免疫组织化学方法检测小鼠海马及下丘脑区ERα、ERβ、FSHR、LHR的表达。 1.3Western Blot方法检测海马中ERβ、P-ERK/ERK、NF-kB、Aβ代谢相关指标(APP，BACE1)、Tau蛋白磷酸化相关指标(P-Tau，CDK5)、凋亡因子相关指标(Bad，Bcl-2，Caspase-3)和谷氨酸受体相关指标(NMDAR，GluR，CAMKII)的蛋白表达量。 1.4试剂盒方法检测海马中乙酰胆碱系统指标（Ach含量及ChAT、AchE的活性），Elisa试剂盒方法检测海马中Aβ、炎症因子相关指标（IL-1β，IL-6，TNF-α）及下丘脑中GnRH、β-EP、SP的含量。 2.细胞实验 2.1采用2×10-5mol/L Aβ25-35作用于PC12细胞建立AD细胞模型。实验分为空白对照组、模型组、雌二醇组、补骨脂素组。MTT法筛选出补骨脂素对Aβ25-35损伤PC12细胞的安全浓度范围和有效浓度。 2.2采用流式细胞术测定细胞凋亡率，Western Blot方法测定细胞内ERβ、P-ERK/ERK及Aβ代谢相关指标(APP，BACE1)的蛋白表达量。 结果: 1.动物实验 1.1新物体识别实验结果显示，与C57组比较，模型组小鼠识别指数明显减少（P＜0.01）;与模型组比较，盐酸多哌奈齐组、抗脑衰胶囊组及补骨脂提取物组识别指数明显增加（P＜0.01）。水迷宫实验结果显示，在空间定位航行实验的第3天和第4天，与C57组比较，模型组小鼠的平均潜伏期明显延长(P＜0.01);与模型组比较，盐酸多哌奈齐组、抗脑衰胶囊组及补骨脂提取物组平均潜伏期明显缩短(P＜0.01);在小鼠空间探索实验中，与C57组比较，模型组小鼠穿越平台次数及靶象限停留时间明显减少(P＜0.05)，与模型组比较，盐酸多哌奈齐组、抗脑衰胶囊组及补骨脂提取物组穿越平台次数及靶象限停留时间明显增加(P＜0.05)。避暗实验结果显示，与C57组比较，模型组小鼠避暗潜伏期及错误次数明显增加（P＜0.01）;与模型组比较，盐酸多哌奈齐组、抗脑衰胶囊组及补骨脂提取物组避暗潜伏期及错误次数明显减少(P＜0.01)。 1.2透射电镜结果显示，与C57组比较，模型组神经元的胞体质膜下出现大量的脂褐素，堆积在一起或散布在胞质内，线粒体改变不明显，部分细胞核膜增厚。神经元核膜较模糊，染色质分布不均匀且有些呈团块状，神经毡区，突触小泡明显减少，有灶性纤维溶解区。与模型组比较，盐酸多奈哌齐、抗脑衰胶囊组及补骨脂提取物组神经元核膜较为清晰可见，细胞核占据细胞的大部分，神经毡区，突触膜平直，突触膜的活性界面较大，突触后膜密度增大，突触小泡略多。 1.3HE染色结果显示，与C57组比较，模型组锥体细胞核排列错乱，海马及下丘脑神经元细胞数量减少、变性、坏死等，分布不均匀、形态不规则，细胞间隙变大，核仁皱缩，细胞质不丰富。与模型组比较，盐酸多奈哌齐、抗脑衰胶囊组及补骨脂提取物组锥体细胞核排列较紧密，海马神经元细胞数量较多、结构趋于完整、分布较均匀、形态较规则，细胞核染色均匀，核仁及核膜清楚可见，细胞质较丰富。 1.4Western Blot结果显示，与C57组比较，模型组海马组织中APP、BACE1、p-Tau396、CdK5、CAMKⅡ、Bad、caspase-3、NF-kB蛋白表达量明显升高（P＜0.05），NMDAR、GluR、Bcl-2、ERβ及p-ERK蛋白表达量明显降低（P＜0.05）;与模型组比较，盐酸多奈哌齐组海马组织中APP、BACE1、p-Tau396、CdK5、CAMKII、Bad、caspase-3、NF-kB蛋白表达量明显降低(P＜0.05)，NMDAR、GluR、Bcl-2蛋白表达量明显升高(P＜0.05)，但ERβ及p-ERK蛋白表达量无明显差异(P＜0.01);抗脑衰胶囊组及补骨脂提取物组海马组织中APP、BACE1、p-Tau396、CdK5、CAMKⅡ、Bad、caspase-3、NF-kB蛋白表达量明显降低（P＜0.05），NMDAR、GluR、Bcl-2、ERβ及p-ERK蛋白表达量明显升高(P＜0.05)。 2.细胞实验 2.1MTT结果显示，与空白组比较，补骨脂素组（10-6μmol/L、10-5μmol/L、10-4μmol/L）作用PC12细胞可使细胞增殖率显著升高，明显促进增殖;补骨脂素(10μmol/L、102μmol/L)作用PC12细胞可使细胞增殖率显著降低，明显抑制增殖;浓度在10-3μmol/L、10-2μmol/L、10-1μmol/L、1μmol/L的补骨脂素对PC12细胞增殖无显著性作用。与模型组比较，雌二醇组及补骨脂素组(1μmol/L)细胞增殖率明显升高（P＜0.01），因此选用补骨脂素组(1μmol/L)用于后续实验。 2.2流式细胞仪结果显示，与空白组比较，模型组细胞总凋亡率明显升高（P＜0.01）;与模型组比较，雌二醇组及补骨脂素组(1μmol/L)细胞总凋亡率明显降低（P＜0.01）。 2.3Western Blot结果显示，与空白组比较，模型组APP和BACE1蛋白表达量及Aβ1-42浓度明显升高(P＜0.05)，ERβ及p-ERK蛋白表达量明显降低(P＜0.01);与模型组比较，雌二醇组及补骨脂素组APP和BACE1蛋白表达量及Aβ1-42浓度明显降低(P＜0.05)，ERβ及p-ERK蛋白表达量明显升高(P＜0.05)。 结论: 1.补骨脂提取物能够有效改善APP/PS1小鼠的学习记忆障碍。 2.补骨脂提取物能够降低APP/PS1小鼠海马区APP和BACE1蛋白的表达，减少海马区淀粉样蛋白Aβ的沉积，降低其对神经元的毒性作用，发挥神经保护作用。 3.补骨脂提取物能够降低APP/PS1小鼠海马区CDK5的表达，抑制海马区Tau的过度磷酸化，减少神经纤维缠结的形成，发挥神经保护作用。 4.补骨脂提取物能够降低APP/PS1小鼠海马区神经元凋亡因子Bad和Caspase-3的表达，增加抗凋亡因子Bcl-2的表达，减少神经元的凋亡，发挥神经保护作用。 5.补骨脂提取物能够通过增加APP/PS1小鼠海马区NMDAR和GluR的表达，降低CaMKⅡ的表达，减少神经元的钙超载现象，发挥神经保护作用。 6.补骨脂提取物能够提高APP/PS1小鼠海马区ChAT的活性，降低AchE的活性，从而增加Ach的含量和胆碱能神经元的活性，发挥神经保护作用。 7.补骨脂提取物能够通过降低APP/PS1小鼠海马区NF-kB的表达，减少IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，改善炎性状态，发挥神经保护作用。 8.补骨脂提取物能够增加APP/PS1小鼠脑中ERβ、ERα、FSHR、LHR的表达，提高ERβ/ERα的表达比例，提示脑中性激素受体，尤其是ERβ主要介导/参与了补骨脂提取物对APP/PS1转基因小鼠的神经保护作用。 9.补骨脂提取物能够增加APP/PS1小鼠下丘脑中GnRH、β-EP、SP的含量，提示补骨脂提取物能够启动下丘脑-垂体-性腺轴，发挥抗AD作用。 10.补骨脂提取物中主要成分补骨脂素能够减少Aβ25-35损伤PC12细胞的凋亡，降低APP和BACE1蛋白的表达，减少淀粉样蛋白Aβ的沉积，降低其对神经元的毒性作用，发挥对AD模型细胞的保护作用，这些作用很可能是通过ERβ/P-ERK细胞信号转导通路所介导的。 11.补骨脂提取物中含有大量植物雌激素类成分，推测这些成分既可以直接作用于海马中ER，通过ERβ/P-ERK信号通路发挥神经保护作用;也可以调节海马中ERβ/ERα的表达比例，提高ERβ介导的神经保护作用。但是，补骨脂抗AD的具体有效成分还尚未确定。
NETL