摘要
高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）隶属于厚壁菌门（Firmicutes）芽胞杆菌属（Bacillus），是常见的植物益生菌。Bacillus altitudinis6ww6从滨海盐碱地分离而得，在盐碱、非盐碱条件下对小麦、玉米有较好的促生作用。本文研究了菌株6ww6的耐盐特征、运动性和生物膜形成能力。通过比较基因组、TBLASTn检索、NR库检索验证、剔除其它同源的结果序列，最终得到菌株6ww6的孤儿基因并设计引物进行PCR鉴定，筛选出了其特异性分子标识。通过蛋白质组学和蛋白修饰组学解析了菌株6ww6的耐盐机理，为该菌株的开发应用提供了充实的理论依据。主要研究结果如下文所示。 （1）对菌株6ww6进行耐盐能力测试，发现其不仅可以在NaCl浓度为1-11%液体LB中生长，而且在盐环境下仍然有较好的运动性和生物膜形成能力，保证了其在盐碱地中可以向作物根际泳动并定殖以形成生物膜来提高作物对盐碱环境的适应性。 （2）基于菌株6ww6可以作为微生物肥料的优选菌种，为了加强菌种知识产权保护，建立菌株快速检测方法，筛选出J939_13195、J9319_05960、J9319_13355、J9319_05965和J9319_13350五个特异性基因。引物5960F和5960R可以单一性扩增出菌株6ww6的目的基因J9319_05960，确定其为菌株6ww6的特异性分子标识。 （3）蛋白质组学数据显示，菌株6ww6在11%NaCl盐胁迫下有457个蛋白表达上调470个蛋白表达下调，分析发现这些差异表达蛋白在核糖体、嘌呤代谢、氨基酸生物合成、双组分系统等途径显著富集；此外，有关胆碱、甜菜碱、海藻糖生物合成与转运的蛋白表达大量上调。将菌株6ww6编码甜菜碱醛脱氢酶的基因J9319_RS14850在大肠杆菌BL21中异源表达，发现可以显著提高其在NaCl浓度为3%、5%LB培养基中的生长速率。 （4）通过4D-Lable乙酰化修饰蛋白组学分析找出了菌株6ww6在盐环境下的乙酰化修饰差异蛋白，其中776个蛋白的乙酰化修饰水平上调，509个蛋白的乙酰化修饰水平下调。分析发现，菌株6ww6经盐胁迫处理后，在一些功能通路中蛋白的乙酰化修饰水平发生了较大的变化，如核糖体蛋白、糖酵解/糖异生、碳代谢、DNA修复等。此外，通过乙酰化基序分析发现除了与目前在真菌、细菌、小鼠等发现的相似乙酰化基序外，还发现了菌株6ww6特有的乙酰化基序如KacV，KacG，KacW，Kac*Y，HKac，E*KacK，KacP，SKac，Kac**H，HKac，尤其是一些碱性氨基酸在Kac位点-10到+10区大量出现，这些基序与菌株6ww6蛋白的酶促和非酶促乙酰化修饰密切相关。 研究表明，盐胁迫下菌株6ww6会通过调节蛋白表达及乙酰化修饰来调控自身的生命活动，如减弱蛋白质翻译、细胞运动性、能量代谢等以降低胁迫环境下细胞的能量损耗；增强嘌呤等核苷酸代谢及脂肪酸降解来为细胞抵御盐胁迫供能；调节氧化还原、DNA修复等相关蛋白的表达及乙酰化修饰水平以降低在盐胁迫下造成的细胞损伤；调节脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甜菜碱、海藻糖等渗透物质的合成来提高胞内的渗透压，以使菌株在适应盐环境后可以恢复胞内正常的生命活动。
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