摘要
猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪肠道α冠状病毒（PEAV）是两种新发现的猪传染性冠状病毒，临床上均以腹泻为主，伴有呕吐等症状，临床症状相似，各年龄段猪均可感染，幼龄仔猪死亡率高达100%，给养猪业造成巨大的经济损失。本研究旨在建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法；对广西壮族自治区部分地区猪腹泻样品进行PDCoV和PEAV检测，探究两种病毒遗传变异及流行现状；针对PDCoV和PEAV的N蛋白抑制Ⅰ型IFN产生的机制进行研究。根据PDCoV和PEAV N基因序列，分别设计特异性引物，以阳性质粒为模板，对二重RT-PCR反应条件优化后进行特异性、敏感性试验；对2017-2018年，采集自广西壮族自治区62份肠道和腹泻样品进行检测，阳性样本进行RT-PCR分段扩增，拼接获得PDCoV全基因组全长。以PDCoV和PEAV基因组为模板，构建N基因真核表达质粒，转染HEK-293T细胞，通过qPCR证实PDCoV和PEAV N蛋白抑制IFN-β的产生，并通过Western blot、Co-IP等实验方法验证具体作用机制。建立的PDCoV和PEAV二重RT-PCR检测方法扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段大小分别为690bp和208bp，且对PEDV、TGEV、PRV和PCV2无扩增条带；对PDCoV和PEAV的最低检测率分别为5.13×102copies/μL、4.73×101copies/μL。62份样品中PDCoV阳性率为19.4%（12/62），PEDV、TGEV和PoRV阳性率分别为32.3%（20/62）、4.8%（3/62）、6.5%（4/62），未检测到PEAV。5株全基因组序列分析显示在非结构蛋白Nsp2、Nsp3分别存在6碱基和9碱基缺失，并且CHN-GX81-2018毒株在S基因和3’-UTR没有基因缺失和插入现象。遗传进化分析表明其中4株与CHN-AH-2004的核苷酸同源性为98.2%-98.4%，属于中国谱系。CHN-GX81-2018毒株与Vietnam/Binh21/2015的核苷酸同源性为98.7%，属于越南/老挝/泰国谱系。PDCoV和PEAV的N蛋白均能抑制Poly I∶C刺激的IFN-β的产生。进一步研究发现PDCoV和PEAV N蛋白通过与RIG-I相互作用，抑制RIG-I的泛素化修饰，同时抑制下游信号通路中的IRF3和p65（NF-κB亚基）的磷酸化，从而抑制IFN-β的产生。
NETL