摘要
大麦是抗逆性较强的作物，但部分大麦品种在驯化和育种过程中丧失了对非生物胁迫的耐受性，因此研究大麦的非生物胁迫响应机制具有重要意义。WRKY基因家族成员广泛分布于植物界，其基因功能涉及植物生长发育、细胞代谢、信号传导、胁迫响应等。然而，大麦WRKY基因家族研究较少，特别是大麦WRKY成员响应非生物胁迫方面的研究。本研究中，我们对大麦WRKY蛋白进行全基因组鉴定及生物信息学分析，并研究了部分成员在胁迫下的表达模式，克隆了3个基因，获得转HvWRKY1的拟南芥苗。最后，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术敲低了2个WRKY成员在大麦中的表达。主要研究结果如下： 1.在大麦基因组中鉴定到了86个WRKY家族成员，编码这些蛋白质的基因不均匀地分布于大麦7条染色体上，按分布位置分别命名为HvWRKY1-HvWRKY86。在这86个基因中，有5组串联重复和12对节段重复基因。大麦86个WRKY蛋白质可按结构和系统发育关系分为三个组或七个亚组。这些成员的基序分布和WRKY结构域的保守位点具有明显的组别差异。它们的编码基因外显子数在1到7之间，含有3个外显子的基因出现频率最高，且编码Ⅰ型和Ⅱb亚型蛋白的基因具有较多的平均内含子数。根据可获得的数据，我们将86个HvWRKY基因在15种不同生长阶段和组织中的表达模式分为13个组，有7个基因不属于任何一组。在幼穗、老叶、根、幼苗的根、节间、穗轴中特异性高表达的基因分别有2、6、18、7、10、1个，表明许多WRKY家族成员的表达具有时空特异性。根据启动子区顺式元件分析结果，我们推测大麦中多数WRKY基因与植物激素信号传导有关，还有部分WRKY基因与胁迫响应相关。另一方面，有46个HvWRKY基因启动子区包含W-box元件，暗示大麦WRKY成员可能具有广泛的转录水平自调节和交叉调节。 2.综合生信分析的结果，选择15个HvWRKY基因，对其在模拟干旱、镉和盐处理下的转录水平进行qRT-PCR分析，发现大部分基因的表达响应一种或多种非生物胁迫。在此基础上，本研究克隆了干旱响应基因HvWRKY1、镉响应基因HvWRKY15和盐响应基因HvWRKY27的全长CDS，并以CaMV35S为启动子驱动HvWRKY1在拟南芥中过表达，获得T1代转基因拟南芥苗。 3.利用VIGS技术敲低了HvWRKY1和HvWRKY15在大麦水培苗中的表达。对VIGSHvWRKY1i和VIGS HvWRKY15i大麦植株进行了胁迫前后脯氨酸、丙二醛和光合色素的测定。发现HvWRKY1的沉默降低了大麦植株中渗透调节物质Pro对干旱胁迫的响应幅度，同时也降低了干旱胁迫下细胞氧化损伤程度。此外，HvWRKY1被沉默后的植株具有更高的光合色素含量。而HvWRKY15表达量的降低有效缓解了镉胁迫引起的渗透调节物质Pro的含量变化，增加了镉胁迫后期相比于前期氧化损伤水平的降低幅度。此外，HvWRKY15表达量的降低还激发了大麦植株镉诱导的Chl a和Car积累，相比之下镉诱导的Chl b积累受到一定程度缓和，因为HvWRKY15表达降低的植株正常培养条件下即具有较高的Chl b含量。在大麦中敲低HvWRKY1后，部分干旱响应基因表达量在沉默植株和野生型植株中有显著差异，并推测HvWRKY1在干旱胁迫下可能参与正调控HvF-box67、HvSOD1、HvSOD2及HvWRKY83的表达，且负调控HvSOD3、HvWRKY32及HvTA6-SFT的表达。
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