摘要
香辛料是指一类具有芳香和辛香等典型风味的天然植物性制品，特指一些干的植物种子、花蕾、果实、茎叶、根块等做成的调味料。香辛料作为生活必需品，广泛应用于烹饪食品和食品工业中。香辛料正品与其混伪品在外观、形状、颜色及气味等各方面特征都很相似，极易引起混淆使用。香辛料伪品会被误认或有意来代替正品，以降低成本，香辛料的掺假现象严重影响了香辛料的产品质量。目前多数食用香辛料没有统一的产品质量标准，对香辛料的鉴定主要采用性状和理化鉴别的方法，但这种方法存在准确性和适应性低等问题。因此，开发准确、快速的香辛料掺伪检测方法，对完善香辛料相关质量标准以及对香辛料的安全使用均具有重要的意义。 本研究以最常见的小茴香、花椒、八角、肉桂、丁香5种香辛料为研究对象，通过比较各种植物香辛料及其常见混伪品的叶绿体基因组及ITS序列，设计引物扩增可能含有多态性的基因片段。通过直接测序及多重序列比对分析，确定了鉴别5种香辛料的目标基因序列，并分别发掘了5种香辛料的单核苷酸多态性（SNP）位点。根据其特异性位点分别设计正品及其混伪品的特异性引物，并利用多重PCR对不同样品进行区分与鉴定，建立了5种香辛料真实性鉴别的DNA分子标记方法。主要内容如下： 1.比较5种香辛料及其混伪品的叶绿体全基因组、核基因组ITS基因以及部分功能基因，筛选了可能存在多态性位点的基因序列。分别设计引物对目标基因序列进行扩增，通过测序及多重序列比对，最终确定accD序列、psbA-trnH序列、trnL-trnF序列、ITS序列、trnL-trnF序列分别作为鉴别小茴香、花椒、八角、肉桂、丁香的目标基因序列。 2.在accD序列中，小茴香在第614bp处碱基为A，而其它四种混伪品均为G；在第786bp处，小茴香的碱基为T而混伪品均为C。在psbA-trnH序列中，花椒在第169bp处碱基为A，而其它三种混伪品均为C；在第510bp处，花椒的碱基为C而混伪品均为A。在trnL-trnF序列中，在第654bp位碱基处，八角茴香为G，而其他两种混伪品均为T；在第815bp处，野八角与莽草均为G，而八角茴香的碱基为A。在ITS序列中，肉桂在第763bp处碱基为A，而其它四种混伪品均为C。在trnL-trnF序列中，在第635、636、637位碱基上，丁香显示为TCC，而在相同位置处，肉桂显示为CGT；第878到897碱基处，丁香表现为缺失。根据发现的特异性位点，可对香辛料正品与混伪品进行鉴别。 3.根据发掘的SNP位点，分别设计5种香辛料与其混伪品的物种特异性引物。根据小茴香在accD序列的SNP位点设计小茴香的特异性引物HAF和其混伪品的特异性引物WAF；根据花椒在psbA-trnH序列的SNP位点设计花椒的特异性引物ZBR和其混伪品的特异性引物ZAR；根据八角在trnL-trnF序列的SNP位点，设计了八角的特异性引物IVF和莽草、野八角的特异性引物ISF；基于肉桂在ITS序列的SNP位点，设计了能够对肉桂特异性鉴别的引物CAR；根据丁香在trnL-trnF序列的特异性位点设计丁香特异性引物TSF和肉桂子特异性引物TCF。 4.探索合适的多重PCR体系和扩增条件。确定多重PCR反应体系为20μL，其中均包括10ng的基因组DNA和10μL的2×Spark Taq PCR Mastermix。小茴香鉴别时加入2μL（0.5μmol/L）的HAF、WAF和HAR；花椒鉴别时加入1μL（0.25μmol/L）的ZBR、ZAR和trnH；八角鉴别时加入2μL（0.5μmol/L）的IVF、ISF和ILR；肉桂鉴别时加入4μL（1μmol/L）的CAR、0.1μL（0.025μmol/L）的IWR和2μL（0.5μmol/L）的CAF；丁香鉴别时加入2μL（0.5μmol/L）的TSF、TCF和trnF。最后加超纯水至20μL。确定多重PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s；退火温度分别为59℃、60℃、55℃、67℃、53℃，时间30s；72℃延伸30s；循环数分别为31、33、34、35、35；最后72℃延伸7min；4℃保温，反应结束。 5.在建立多重PCR体系下，小茴香和其混伪品分别扩增出336bp和168bp的特异性条带；花椒和其混伪品分别扩增出517bp和188bp的特异性条带；八角茴香和其混伪品分别扩增出304bp和152bp的特异性条带；肉桂扩增出292bp和629bp的条带，而其他混伪品则都只扩增出一条292bp的条带；丁香和肉桂子分别扩增出232bp和147bp的特异性条带。从而有效实现香辛料正品及其混伪品的分子鉴定。 6.所开发方法检测限的确定。本研究建立的多重PCR体系可以检测到0.1%的混伪品掺入，检测限低至0.01ng。 本研究开发了一种简单、准确、高效的DNA分子标记方法用于5种植物香辛料的真实性鉴别，与传统的形态学及化学鉴别方法相比，本方法克服了传统鉴别方法准确性和适应性低等问题，为其他香辛料的鉴别提供了方法借鉴，对完善香辛料相关质量标准以及对香辛料的安全使用均具有十分重要的意义。
NETL