摘要
目的： 本研究以“补益阳明津气”理论为指导，采用子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）大鼠模型评价益胃汤的拮抗效应后，采用网络药理学和分子对接技术预测其作用机制和物质基础，然后对预测的主要活性成分的作用及机制进行进一步验证研究，籍以揭示益胃汤改善子宫内膜异位症的作用机制，阐明“补益阳明津气”法改善子宫内膜异位症的现代生物学基础。 方法： 1.子宫内膜异位症模型的制备 采用自体移植法制备子宫内膜异位症大鼠模型，相同手术操作但不植入子宫内膜片段的大鼠为假手术对照组。造模28d后二次开腹检测和评价异位内膜组织生长情况，筛选造模成功的大鼠进行后续实验。 2.益胃汤改善子宫内膜异位症的有效性评价研究 按照体质量和异位内膜组织体积将造模成功的大鼠进行随机分组，假手术对照组（SHAM,n=7），模型对照组（MODEL,n=8）、达那唑对照组（DNZ,70mg/kg,n=8）、益胃汤中剂量组（YWTM,13.5g/kg,n=8）及益胃汤高剂量组（YWTH,27g/kg,n=8）；模型和假手术对照组给予生理盐水，给药组大鼠给予相应药物，给药方式为灌胃，给药体积为10mL/kg/d，给药时间为28d；通过测量异位内膜组织的长、宽、高并按照体积公式（V=长?宽?高）计算体积，以及通过HE染色考察益胃汤对EMs大鼠异位子宫内膜组织病理形态学的影响； 3.益胃汤改善子宫内膜异位症的作用机制预测研究 运用网络药理学方法预测益胃汤改善子宫内膜异位症的作用机制和主要的物质基础。通过中药系统药理学分析平台（TCMSP），中药系统药理学成分分析平台(BATMAN-TCM)和中医药百科全书数据库（ETCM）及2020版《中国药典》获取益胃汤中4味中药的主要活性成分，通过TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM、PharmMapper、Swiss Target Prediction、DART-CPI、DrugBank和STITCH数据库获取益胃汤活性成分的作用靶点。借助GeneCards，DisGeNET，TherapeuticTarget Database(TTD)，遗传药理学和药物基因组学数据库(PharmGkb)筛选子宫内膜异位症的疾病靶点。用Cytoscape_3.7.2软件构建“中药活性成分-交集靶点-子宫内膜异位症”网络图；使用STRING数据库和Cytoscape_3.7.2软件建构靶蛋白相互作用网络图，利用R语言软件对共有靶点进行GO生物过程和KEGG通路富集分析。最后，结合高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）定性分析益胃汤标准水煎液中梓醇与欧前胡素，确定后续研究的活性成分及机制通路。 4.梓醇、欧前胡素改善子宫内膜异位症的有效性及作用机制研究 梓醇实验分组为SHAM组（n=8）、MODEL组（n=8）、DNZ组（70mg/kg,n=8）、梓醇低剂量组（CPL,7mg/kg,n=8）、梓醇高剂量组（CPH,14mg/kg,n=8），给予梓醇干预后，考察异位子宫内膜组织体积、质量和病理形态学的变化；结合网络药理学和分子对接预测梓醇改善子宫内膜异位症的作用机制；实验验证分为体内和体外两部分，体外实验采用HeLa细胞为研究载体，采用MTT法考察梓醇对HeLa细胞存活率的影响后，选择12.5，25和50?M三个给药浓度进行验证梓醇的作用机制，即分组为空白对照组（Control）、梓醇低剂量组（12.5?M）、梓醇中剂量组（25?M）、梓醇高剂量组（50?M）；采用ELISA法分别考察梓醇对血清及腹腔液中VEGF浓度的影响；采用Western blotting考察梓醇对Akt/JNK/NF-?B通路中靶标蛋白表达水平的影响。 欧前胡素实验部分分组为SHAM组（n=8）、MODEL组（n=8）、DNZ组（70mg/kg，n=8）、欧前胡素低剂量组（IMPL，5mg/kg，n=8）、欧前胡素高剂量组（IMPH,10mg/kg,n=8），给药干预后，采用相同的指标和方法评价欧前胡素的疗效以及预测其作用机制；采用ELISA法考察欧前胡素对血清和腹腔液中的TNF-?和IL6浓度的影响；采用Western blotting欧前胡素对PI3K/Akt/NF-?B通路中靶标蛋白表达水平的影响。 结果： 1.益胃汤改善子宫内膜异位症作用确切 给药干预28d后，与模型对照组相比，达那唑对照组和益胃汤各剂量组显著减小异位内膜组织体积和质量（p＜0.05）；与假手术对照组相比，模型对照组出现腺体扩增、大量炎性细胞浸润和血管新生等变化，然而，达那唑对照组和益胃汤高剂量组明显改善上述病理组织学变化； 2.益胃汤改善子宫内膜异位症主要与PI3K/Akt通路有关 从益胃汤中筛选出活性成分58个以及1165个作用靶点，子宫内膜异位症共收集疾病靶点2196个，二者交集靶点为320个；“中药活性成分-交集靶点-子宫内膜异位症”网络拓扑分析获取12个关键活性成分，槲皮素（Quercetin）、欧前胡素（Imperatorin）、梓醇（Catalpol）、γ-氨基丁酸（Gamma-Amino butyric Acid）、腺苷（Adenosine）、尿苷（Uridine）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、麦冬黄烷酮E（Ophiopogonanone E）、豆甾醇(Stigmasterol)、甲基麦冬酮B(Methylophiopogonanone B)、柠檬酸(Citric acid)和5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural)；GO富集分析主要涉及对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)，腺体的发育(gland development)和对组胺的反应(response to steroid homone)；KEGG富集分析主要涉及PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路和雌激素信号通路等；基于PPI和KEGG网络拓扑分析，发现益胃汤主要通过调控PI3K/Akt信号通路发挥作用，同时14个关键靶点：MAPK1、MAPK3、AKT1、PIK3CA、JUN、MAPK8、RELA、FOS、EGFR、MAPK14、IL6、EGF、SRC和VEGFA被获取。由于槲皮素已被证实具有改善子宫内膜异位症的作用，而梓醇和欧前胡素均没有。同时HPLC法检测证实益胃汤标准水煎液中存在梓醇与欧前胡素两种成分。因此，最终选择梓醇和欧前胡素进行益胃汤改善子宫内膜异位症的物质基础研究。 3.梓醇改善子宫内膜异位症的作用及机制研究 3.1梓醇改善子宫内膜异位症作用确切 给药干预28d后，与模型对照组相比，达那唑对照组和梓醇各剂量组显著减小异位内膜组织的体积和质量（p＜0.05）。与假手术对照组相比，模型对照组出现明显的腺体增生和血管新生等现象，然而，达那唑对照组和梓醇高剂量组明显改善了上述现象。 3.2梓醇抑制Akt/JNK/NF-?B通路的激活 经预测分析，梓醇可能通过调控Akt/JNK/NF-?B/VEGF通路改善子宫内膜异位症；体内研究：与假手术对照组相比，模型对照组血清及腹腔液中的VEGF的浓度显著增高（p＜0.05），与模型对照组相比，达那唑对照组和梓醇高剂量组显著降低血清和腹腔液中VEGF的浓度（p＜0.05）；与假手术对照组相比，模型对照组p-Akt，p-JNK和p-P65的表达水平显著增高（p＜0.05），与模型对照组相比，达那唑对照组和梓醇高剂量组显著降低p-Akt，p-JNK和p-P65的表达水平（p＜0.05）；体外研究：与空白对照组相比，梓醇高、中剂量组（50?M，25?M）显著降低p-JNK和p-P65的表达水平（p＜0.05）。 4.欧前胡素改善子宫内膜异位症的作用及机制研究 4.1欧前胡素改善子宫内膜异位症疗效确切 给药干预28d后，与模型对照组相比，达那唑对照组和欧前胡素各剂量组显著减小异位内膜组织的体积和质量（p＜0.05）；与假手术对照组相比，模型对照组出现腺体增生，空泡化，炎症细胞浸润等病理形态学变化，然而，达那唑对照组和欧前胡素高剂量组明显改善了上述变化。 4.2欧前胡素抑制PI3K/Akt/NF-?B通路的激活 经预测分析，欧前胡素可能通过调控PI3K/Akt/NF-?B通路改善子宫内膜异位症；与假手术对照组相比，模型对照组血清和腹腔液中TNF-?和IL6的浓度显著增高（p＜0.05），与模型对照组相比，达那唑对照组和欧前胡素高剂量组显著降低血清和腹腔液中TNF-?和IL6的浓度（p＜0.05）；假手术对照组相比，模型对照组的p-PI3K,p-Akt,p-P65的表达水平显著增高（p＜0.05），与模型对照组相比，达那唑对照组和欧前胡素各剂量组显著降低p-PI3K,p-Akt,p-P65的表达水平（p＜0.05）。 结论： “补益阳明津气”的代表方剂-益胃汤具有确切的改善子宫内膜异位症的作用，其机制主要与调控PI3K/Akt信号通路有关；梓醇可通过Akt/JNK/NF-κB/VEGF通路抑制子宫内膜异位症血管生成过程；欧前胡素可通过PI3K/Akt/NF-κB通路抑制子宫内膜异位症炎症反应。
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