摘要
目的：本研究旨在阐释吴氏泻心汤治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的作用机制并结合动物实验进行验证，以期为临床治疗提供实验依据。 方法：（1）通过网络药理学方法对吴氏泻心汤治疗NAFLD的潜在机制进行分析，借助TCMSP数据库提取吴氏泻心汤的活性成分及潜在靶点，使用Uniprot数据库对靶点名称进行规范化处理，构建成分-靶点网络；检索TTD、GeneCards、OMIM、PharmGkb、CTD数据库得到NAFLD的预测靶点，利用R软件将吴氏泻心汤与NAFLD靶点取交集；通过Cytoscape软件构建“吴氏泻心汤药物成分与NAFLD疾病靶点”网络，利用STRING数据库建立PPI网络来筛选关键靶点，通过R软件对吴氏泻心汤治疗NAFLD的交集靶点进行GO功能富集分析与通路富集分析，并结合文献报道筛选吴氏泻心汤治疗NAFLD的重要信号通路，利用GEO数据库对吴氏泻心汤治疗NAFLD的核心靶点进行分析，并绘制ROC曲线，分析核心靶点诊断效能，最后对网络药理学结果进行解释分析。 （2）基于网络药理学分析结果，设计动物实验验证吴氏泻心汤对NAFLD的治疗作用以及对重要信号通路的调控作用，具体步骤为：采用“60%高脂饲料+腹腔注射链脲佐菌素（STZ）”造模法制备NAFLD小鼠模型，经过吴氏泻心汤7周干预治疗后，观察小鼠的一般情况、血清生化指标（ALT、AST、TC、TG）、HE染色、油红O染色及肝指数的差异情况；ELISA法检测小鼠肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β的含量；实时荧光定量PCR法（qPCR）检测小鼠肝组织TLR4、NF-κB、NLRP3的mRNA表达水平；免疫组织化学法（IHC）检测小鼠肝组织TLR4、NF-κB、NLRP3的蛋白表达水平；Western Blot法检测小鼠肝组织TLR4、NLRP3的蛋白表达水平。 结果：（1）网络药理学分析结果：吴氏泻心汤的活性成分共收集到97个，其中黄芩36个，半夏13个，黄连14个，枳实有19个，杏仁1个；NAFLD疾病靶点共收集到1830个，其中CTD数据库1个，GeneCards数据库1611个，OMIM数据库151个、PharmGkb数据库135个、TTD数据库5个；吴氏泻心汤与NAFLD的交集靶点为108个，核心靶点有10个；GO功能富集分析显示：主要参与对营养水平、氧化应激等生物学过程的反应；KEGG通路富集分析显示：主要涉及TNF、TOLL样受体、NF-κB等信号通路；GEO数据库获取健康者和NAFLD患者肝组织的表达谱芯片GSE63067，显示TLR4在健康者和NAFLD患者中有差异（P＜0.05）；ROC曲线下面积为0.81，提示TLR4可以作为正常者与NAFLD患者的差异表达蛋白。 （2）动物实验结果：①与正常组比较，模型组小鼠精神倦怠萎靡、喜蜷卧，反应比较迟钝，活动度减少，毛发油腻增加显著，与模型组比较，各用药组小鼠精神状态、反应度、毛发色泽、活动度均有不同程度改善；②与正常组比较，模型组小鼠肝组织病理显示可见大量肝细胞脂肪变性，胞质内见许多圆形空泡，与模型组比较，各治疗组小鼠均有不同程度改善；③与正常组比较，模型组小鼠油红O染色肝细胞内脂滴连续不断，呈现弥散堆积性改变，与模型组比较，各治疗组小鼠均有不同程度减轻；④与正常组比较，模型组小鼠血清ALT、AST、TC、TG以及肝指数明显升高（P＜0.05），与模型组比较，各治疗组小鼠血清ALT、AST、TC、TG以及肝指数均有不同程度降低（P＜0.05）；⑤与正常组比较，模型组小鼠肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β明显升高（P＜0.05），与模型组比较，各治疗组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β均有不同程度降低（P＜0.05）；⑥qPCR检测各组小鼠肝组织中TLR4、NF-κB、NLRP3mRNA的基因表达水平，与正常组比较，模型组小鼠肝组织的TLR4、NF-κB、NLRP3mRNA的基因表达升高（P＜0.05），与模型组比较，各治疗组小鼠能够在不同程度上抑制小鼠TLR4、NF-κB、NLRP3mRNA的基因表达水平（P＜0.05）；⑦IHC法检测小鼠肝组织中TLR4、NLRP3、NF-κB的蛋白表达水平，与正常组比较，模型组小鼠肝组织TLR4、NLRP3、NF-κB的蛋白表达显著升高（P＜0.05），与模型组比较，各治疗组小鼠能够在不同程度上降低小鼠肝组织中TLR4、NLRP3、NF-κB的蛋白在胞浆与胞核中的表达水平（P＜0.05）；⑧Western blot检测各组小鼠肝组织中TLR4、NLRP3的蛋白表达水平，与正常组比较，模型组小鼠肝组织TLR4、NLRP3的蛋白表达明显上升（P＜0.05），与模型组比较，各治疗组小鼠能够在不同程度上降低小鼠肝组织中TLR4、NLRP3的蛋白表达水平（P＜0.05）。 结论：（1）结合网络药理学与GEO数据库分析，TOLL受体信号通路可能为吴氏泻心汤治疗NAFLD的关键通路；（2）动物实验表明，吴氏泻心汤可通过抑制TLR4/NF-κB、NLRP3信号通路减轻炎症反应，改善肝指数、肝脏功能及病理形态。
NETL