摘要
背景、科学问题和意义： 根据营养状态变化调节生理过程是生物体最基本的生命活动之一，其中很重要的一种机制就是营养物质代谢的中间产物作为翻译后修饰(post-translation modification,PTM)的供体分子与功能蛋白共价结合，从而调节它们的活性、稳定性、蛋白质折叠和细胞定位等以应答营养状态的改变。近年来广泛研究的琥珀酰化是PTMs的一种，琥珀酰基团可通过酶促或非酶促的方式结合在靶标蛋白赖氨酸残基的ε-氨基上，再由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的沉默信息调节蛋白2相关酶5(sir2-related enzyme5，SIRT5)负责去除。由于其底物琥珀酰基团来源于琥珀酰辅酶A，细胞核心代谢途径三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)的中间产物，因此琥珀酰化可能是细胞响应代谢状态变化，调节生命活动进程的重要机制，但其作用的靶标分子和调节机制仍需进一步探索。 昆虫是地球上种类最多、数量最大的生物群体，其适应环境、保持种群的方式之一就是在不同发育阶段表现出完全不同的形态结构和生活习性，这一过程称为变态，变态发育的调节机制一直是昆虫学领域的研究热点。昆虫的末龄幼虫在取食阶段摄取大量食物为蛹期和羽化积累营养，进入变态蜕皮阶段后则不吃少动，这两个阶段幼虫的代谢与生理状态差异明显，为研究琥珀酰化调节生理过程作用机制提供了良好模型。此外，昆虫变态受到20羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)、保幼激素(Juvenile hormone，JH)和胰岛素(Insulin)的协同调控。目前昆虫变态发育的分子机制研究也集中在这三种激素通过膜受体或核受体激活下游基因的转录与翻译过程上，琥珀酰化这类受代谢影响的PTM在其中的作用未见报道。 基于以上，本论文拟以鳞翅目完全变态类农业害虫棉铃虫(Helicoverpa arm igera)为材料，探索琥珀酰化调节昆虫变态发育的分子机制，既有助于鉴定琥珀酰化的靶标分子，探索琥珀酰化的作用机制，又可完善激素调控昆虫变态发育的机制，为害虫生物防治提供新的靶标，在基础研究和生产应用方面都具有参考价值。 结果： 为了解昆虫变态发育过程中蛋白琥珀酰化修饰状态的变化，将末龄取食期幼虫与变态蜕皮期幼虫总蛋白分别用琥珀酰化抗体富集后进行液相色谱-质谱联用(liquid chromato graphy-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)分析、比较发现，共有180种蛋白琥珀酰化修饰状态发生了变化，其中173种在变态期琥珀酰化程度降低，11种修饰程度升高。生物信息学分析表明，这些差异琥珀酰化蛋白主要富集在毒素和异物素代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、糖酵解/糖异生等代谢途径中。进一步选取可能与变态相关的生理过程及激素信号途径相关因子作为靶标，验证组学可靠性，包括富集在乙醛酸和二羧酸代谢途径中的过氧化氢酶(catalase，CAT)，以及20E信号途径的重要因子G蛋白偶联受体激酶1(G-protein coupled receptor kinase1，GRK1)和胰岛素降解相关的胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)，免疫印迹验证结果与质谱数据相一致。为研究琥珀酰化状态发生变化是否能够影响变态发育，使用Sirtuin家族抑制剂烟酰胺(nicotinamide，NAM)抑制SIRT5的去琥珀酰化作用，结果显示，棉铃虫变态过程受到抑制，出现化蛹时间延长、化小蛹的现象，且20E及胰岛素信号途径关键因子的转录也受到抑制，说明琥珀酰化可能通过抑制20E、胰岛素等信号途径从而抑制变态发育。为进一步探索琥珀酰化修饰的上游调节机制，对Sirt5在mRNA的表达模式进行检测，实时定量PCR结果显示，Sirt5在变态时期表达量较高，并且可被20E上调。 结论： 综上，在棉铃虫取食期营养充足的条件下多种蛋白发生琥珀酰化修饰，可以防止变态提前发生，去除琥珀酰化后启动变态。这可能与变态过程中20E水平升高，在mRNA水平上调去琥珀酰化酶Sirt5的表达有关。
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