摘要
半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease)是一类参与逆境胁迫例如低温、干旱、盐胁迫、植物免疫、种子萌发和植物细胞程序性死亡（Programmed Cell Death，PCD）等多种植物生理过程的重要蛋白酶家族。实验室前期研究中克隆获得了毛果杨PtCP5（Populus trichocarpa Cysteine Protease5）基因。在此基础上本研究首先克隆了毛果杨PtCP5基因启动子片段，并对其顺式作用元件、组织定位表达、亚细胞定位特点等进行分析，同时比较转基因PtCP5拟南芥正常和逆境胁迫条件下的表型特征，从而探讨PtCP5的可能生物学功能。 主要结果如下： 1.克隆得到毛果杨半胱氨酸蛋白酶PtCP5基因启动子片段，序列全长1372bp，启动子顺式作用元件分析发现PtCP5启动子中主要含有G-box响应光调节有关的元件，ABRE响应ABA的元件，AuxRR-core响应IAA生长素的元件，TATC-box响应赤霉素的元件，TGACG-motif和CGTCA-motif响应茉莉酸甲酯的元件，MYB和MYC响应干旱和ABA的元件。PtCP5启动子分析发现了与光响应、非生物胁迫响应、激素响应和生长发育响应相关的顺式作用元件，表明PtCP5可能参与多种胁迫信号应答的调控途径，并在调控毛果杨的生长发育和逆境调控过程中发挥关键作用。 2.构建了PtCP5自身启动子连接GUS基因的载体ProPtCP5-GUS-pBI121，并转化拟南芥。转基因拟南芥根、茎、子叶、花等部位可以明显检测到GUS活性。同时构建了35S-PtCP5-GFP载体并转化烟草，瞬时表达分析发现PtCP5定位于细胞质。推测PtCP5基因可能参与蛋白质动员和降解。 3.对PtCP5转基因拟南芥表型进行分析，结果显示：（1）PtCP5转基因种子的萌发较野生型（WT）拟南芥种子萌发延缓，PtCP5转基因和WT种子在成熟过程各阶段中种皮厚度、蛋白质种类等没有显著差异。PtCP5转基因种子储存蛋白含量较WT显著降低，表明PtCP5参与种子中储存蛋白的动员。过表达PtCP5拟南芥中储存蛋白的过早动员可能是导致种子萌发缓慢的原因。（2）转基因PtCP5拟南芥花发育正常，而转基因PtCP5拟南芥花粉大部分形态异常，表明PtCP5的过表达造成花粉损伤。（3）甘露醇模拟的干旱胁迫和NaCl模拟的盐胁迫实验显示PtCP5转基因植株种子的萌发率较未处理显著降低，表明PtCP5的过表达导致PtCP5转基因幼苗的抗旱和抗盐能力较差。 4.根据将实验室前期构建的pET30a-AtβVPE，pET30-PtCP1，pET30(+)-PtCP5重组表达载体菌株，进行IPTG诱导体外原核表达获得重组蛋白。重组蛋白AtβVPE、PtCP1和PtCP5以包涵体形式存在，通过进一步纯化获得可溶性蛋白。使用AtβVPE对PtCP1和PtCP5进行了体外激活尝试，没有能够获得成熟PtCP1和PtCP5蛋白，表明AtβVPE可能不能在体外将PtCP1、PtCP5前体蛋白转化激活形成成熟蛋白，半胱氨酸蛋白酶PtCP1、PtCP5酶原激活的过程中可能由其他蛋白酶的激活。 本研究对毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5启动子表达定位进行研究，并探讨PtCP5的可能生物学功能，对揭示半胱氨酸蛋白酶家族在木本植物中的功能研究有着重要意义。
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