摘要
背景：结直肠癌(CRC)不仅是世界上第三大最常见的癌症，同时也是全球第四大致命性癌症。在2020年由于CRC所致的死亡率达到了9.4%的比例，结直肠癌患者的复发转移是引发死亡的重要原因。microRNA（miRNA）属于一大类非编码RNA(NcRNAs)，是具有高度保守性的非编码RNA，它参与的血管生成与肿瘤的复发和转移密切相关。解毒益气祛瘀方是课题组多年来在结直肠癌基础实验研究和临床研究的基础上总结出来的方剂，其疗效肯定，对结直肠癌具有一定程度的抗复发转移作用，其机制与血管生成有关，有待深入研究。 目的：本研究从miR-133a着手，前期运用生物信息学方法，根据研究需要运用各种在线数据库和软件，结合文献研究探索在结直肠癌中差异表达的miRNA，后期收集临床标本验证miR-133a在结直肠癌的表达情况，并用中药血清干预的细胞培养的方式来阐释miR-133a在结直肠中的作用机制并进一步丰富解毒益气祛瘀方的治疗作用机制。 方法：1.生物信息学方法：通过利用大数据环境下的GEO数据库下载已发表结直肠癌的数据集，采用GEO2R软件分析数据集里差异表达的miRNAs。 2.组织标本检测：选取30例被病理诊断为原发性结直肠癌的癌组织及癌旁组织，并且在术前未进行其它任何非手术治疗。实时荧光定量PCR检测目的miRNA的表达，免疫组化检测CD31阳性表达的MVD形成情况，Pearson相关性分析探讨结直肠癌中miR-133a表达与MVD的相关性。 3.体外实验：雌雄各半SD大鼠制备成解毒益气祛瘀方含药血清。按常规方法对LOVO-HUVEC进行共培养，按剂量大小设置低、中、高剂量3个组解毒益气祛瘀配伍方含药血清组和3个对照组（阳性对照药物5-FU组、空白对照组及溶剂对照组），CCK-8检测不同剂量含药血清组及5-FU对HUVEC细胞的抑制率；Transwell小室观察不同剂量含药血清组及5-FU对HUVEC细胞迁移的抑制作用；含药血清观察HUVEC成管的抑制作用；提取各组中药含药血清组和对照组干预的细胞总蛋白，QRT-PCR检测miR-133a的表达，Western Blot检测血管生成相关靶点VEGFA、VEGFR2的表达，探讨miR-133a/VEGFA/VEGFR2在解毒益气祛瘀配伍方干预下的作用机制。 结果：1.生物信息学结果显示：miR-133a可能是结直肠中差异表达显著的miRNA之一。 2.临床标本检测结果显示，CD31在癌组织表达的MVD阳性率为22.342±5.392，在癌旁组织的MVD阳性率为7.927±2.050；miR-133a在结直肠癌组织中的表达低于癌旁组织（p＜0.05）。 3.CCK-8法结果显示：解毒益气祛瘀方不同剂量含药血清在加药后3d均可一定程度地抑制HUVEC细胞增殖，与时间和剂量呈现正相关的关系。 4.Transwell结果显示：解毒益气祛瘀配伍方含药血清不同剂量组在加药后可一定程度地抑制HUVEC细胞迁移。 5.成管试验显示：解毒益气祛瘀配伍方含药血清可一定程度抑制HUVEC成管。 6.Western Blot结果显示：与溶剂对照组、空白对照组相比，解毒益气祛瘀配伍方含药血清干预的细胞中VEGFA、VEGFR2蛋白的表达均降低（p＜0.05），miR-133a的表达升高（p＜0.05），提示解毒益气祛瘀方含药血清可能通过调控miR-133a/VEGFA/VEGFR2信号通路抑制结直肠癌血管生成。 结论：1.miR133a在结直肠癌中下调，可能通过干预血管生成参与了结直肠癌的发生发展，是治疗结直肠癌的一个新的潜在靶点； 2.解毒益气祛瘀方对HUVEC细胞增殖、迁移、成管存在抑制作用； 3.解毒益气祛瘀方可能通过升高miR133a的表达水平，下调VEGFA、VEGFR2的表达，抑制结直肠癌血管生成，呈现剂量依赖性的特点。
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