摘要
目的：利用细胞学实验阐明芥子酸（Sinapicacid,SA）对胰腺癌（pancreatic cancer,PC）细胞增殖，迁移与侵袭抑制作用；通过分子生物学技术研究AKT/GSK-3β通路介导SA抑制PC的作用机制；并在动物学水平通过裸鼠皮下成瘤模型，验证SA对PC实体瘤的抑制作用，探究SA作为临床治疗药物的可行性，为PC药物研究及治疗提供新策略。 方法：1.用CCK-8法检测不同浓度SA作用下人PC细胞（PANC-1及SW1990）和正常人胰腺导管上皮细胞（HPDE）的增殖情况；2.克隆形成实验观察SA对肿瘤细胞克隆形成能力的影响；3.细胞划痕和Transwell实验观察SA对细胞迁移与侵袭能力的作用；4.肿瘤异种移植模型分析SA对裸鼠皮下成瘤的影响；5.蛋白印迹法（Western blot,WB）检测SA处理对细胞及肿瘤组织中增殖、上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）及AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白的表达情况；6.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SA对细胞及组织中基质金属蛋白酶2和9（MMP-2、MMP-9）活性的影响；7.Hamp;E及免疫组化染色（IHC）观察SA对肿瘤组织形态改变及相关蛋白在组织中的表达的影响；8.利用AKT特异性激动剂（SC79）预处理PC细胞后再予以SA干预，检测AKT,p-AKT及其下游GSK-3β的表达情况，并再次检测细胞增殖，迁移与侵袭及相关蛋白的变化。 结果：1.采用不同浓度SA分别作用于PANC-1、SW1990细胞24及48小时，检测细胞活性发现，SA对PC细胞增殖具有浓度和时间依赖性的抑制作用，通过计算相应的IC50值，最终选择0mM,2.5mM，5mM，10mM作为后续实验浓度，发现在这些浓度范围内，SA对正常胰腺导管上皮细胞并无毒性作用；克隆形成实验进一步验证了SA对PC细胞的增殖具有浓度依耐性的抑制作用；并且WB结果显示，细胞增殖相关蛋白（CDK2、Cyclin E1、CDK4、Cyclin D1）随药物浓度的增加及中浓度药物作用时间的延长而下调；2.细胞划痕及Transwell实验验证SA呈时间和浓度依耐性抑制PC细胞的迁移和侵袭；WB结果显示，EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin、Snail、MMP-2、MMP-9）也呈时间和浓度依耐性下调，细胞中MMP-2、MMP-9酶活性变化呈同样趋势；3.SA下调AKT/GSK-3β通路蛋白，随着SA浓度的升高，p-AKT和GSK-3β的表达均逐渐下调，但AKT的变化不明显，仅在较高浓度时略有下降。在时间梯度中，p-AKT和GSK-3β的表达随着时间的延长而下调，而AKT的表达未发生改变。4.SA抑制PC肿瘤生长，较对照组明显生长缓慢，并且最终的肿瘤重量及肿瘤/体重比也更低；此外，Hamp;E染色观察到对照组肿瘤组织结构更加紊乱，免疫组化证实p-AKT、Vimentin和CDK4在对照组中表达更高；WB和ELISA结果证实细胞增殖、EMT及AKT/GSK-3β通路蛋白在药物组中下调。5.AKT激动剂SC79恢复了细胞的增殖、迁移、侵袭能力和AKT/GSK-3β信号通路的表达。 结论：1.SA呈浓度及时间依赖性地抑制PC增殖、迁移和侵袭，并下调相关蛋白表达。2.SA能有效抑制PC肿瘤的生长。3.SA下调PC中AKT/GSK-3β信号通路的表达。4.AKT激动剂SC79上调AKT/GSK-3β信号通路，并减弱SA对PC细胞的抑制作用。
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