摘要
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，在大多数国家中构成女性癌症相关死亡的首位原因。在我国，乳腺癌的发病率和死亡率逐年上升，严重威胁了女性的生命健康安全。乳腺癌是一种高度异质的全身性疾病，需根据其病理分型制定个体化的综合治疗策略。为减轻耐药性及毒副作用，降低乳腺癌复发和转移的概率，新的治疗靶点亟待发掘。 铁死亡是近年来的研究热点，其特征为铁离子依赖性的脂质过氧化。靶向铁死亡的干预措施在恶性肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景。小分子化合物Erastin通过多位点诱发铁死亡，并可在联用多种抗癌药物时产生协同效应，因此有望用作化疗和放疗的增敏剂。铁死亡与自噬等其他死亡方式之间已被推测存在网状关联。我们在前期工作中发现Erastin可以诱导乳腺癌细胞自噬，但关于自噬如何调控铁死亡尚无明确定论，因此我们研究自噬在Erastin诱导乳腺癌细胞铁死亡中的作用及机制，以期为其临床应用提供理论依据。 目的： 明确自噬在Erastin诱导乳腺癌细胞铁死亡中的作用并探究其机制。 方法： 1、细胞增殖及死亡检测：CCK-8法检测Erastin对乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231及SKBR3细胞增殖抑制率，LDH释放试验检测Erastin对乳腺癌细胞的毒性作用及合加抑制剂后的细胞死亡率。 2、细胞铁含量检测：Calcein染色法测定Erastin作用于乳腺癌细胞后胞内不稳定铁池（Labile Iron Pool,LIP）的变化；检测去铁铵（Deferoxamine,DFO）预处理1h后Erastin诱导的乳腺癌细胞内LIP含量的变化。铁离子比色法测定过氧化氢（Hydrogen Peroxide,H2O2）作用于乳腺癌细胞后胞内Fe2+含量的变化；检测还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）预处理1h后H2O2诱导的乳腺癌细胞内Fe2+浓度的变化。 3、细胞蛋白表达水平检测：Western Blotting法检测Erastin时间梯度样品以及Erastin合加抑制剂样品的铁死亡及自噬相关蛋白含量的变化。 4、细胞内过氧化氢浓度检测：测定Erastin作用于乳腺癌细胞后过氧化氢浓度的变化；检测抑制剂预处理1h后Erastin诱导的乳腺癌细胞内过氧化氢含量的变化。 5、细胞内半胱氨酸(Cysteine,Cys)浓度检测：测定Erastin作用于乳腺癌细胞后半胱氨酸浓度的变化；检测抑制剂预处理1h后Erastin诱导的乳腺癌细胞内半胱氨酸含量的变化。 6、细胞内总谷胱甘肽浓度检测：测定Erastin作用于乳腺癌细胞后GSH浓度的变化；检测抑制剂预处理1h后Erastin诱导的乳腺癌细胞内GSH含量的变化。 7、细胞脂质过氧化水平检测：C11-BODIPY581/591染色法测定Eratin作用于乳腺癌细胞后脂质过氧化程度的变化；抑制剂预处理1h后Erastin诱导的乳腺癌细胞脂质过氧化水平的变化。 8、细胞基因表达水平检测：siRNA沉默ATG5基因后，检测Erastin浓度梯度作用于乳腺癌细胞后细胞内过氧化氢及蛋白含量的变化。 结果： 1、Erastin可以抑制乳腺癌细胞的增殖并以剂量依赖的形式增加胞内LIP及铁死亡相关蛋白的水平，此过程可被DFO阻断。 2、Erastin以时间和浓度依赖的方式促进乳腺癌细胞内过氧化氢积累，过氧化氢以剂量依赖的方式促进细胞内铁离子累积及铁死亡相关蛋白的水平，且该过程可被抗氧化剂GSH抑制。 3、Erastin以时间依赖的方式促进乳腺癌细胞的自噬相关蛋白表达，用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）、巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1,Baf-A1）可抑制Erastin诱导的乳腺癌细胞的铁死亡相关蛋白表达，过氧化氢的积聚和细胞死亡。 4、Erastin以时间和剂量依赖方式导致乳腺癌细胞半胱氨酸、GSH、胱氨酸/谷氨酸反向转运体轻链亚基（SLC7A11,xCT）及过氧化氢酶（catalase）的消耗，且该过程可被自噬抑制剂3-MA、Baf-A1抑制；ATG5基因的敲低阻止了Erastin诱导的乳腺癌细胞xCT及catalase的表达下调。 结论： 1、Erastin抑制人乳腺癌细胞的增殖并诱导其死亡。 2、Erastin导致人乳腺癌细胞中过氧化氢的积聚和还原性谷胱甘肽的耗竭。 3、Erastin通过诱导乳腺癌细胞自噬来提高细胞内亚铁离子浓度和过氧化氢含量。 4、过氧化氢通过提高细胞内亚铁离子含量促进Erastin诱导的铁死亡。 5、Erastin通过自噬清除xCT和catalase，进而促进人乳腺癌细胞内过氧化氢的积累。
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