摘要
研究目的： 本研究利用野生型及C3ar基因敲除的模式动物建立小鼠牙周炎模型后观察差异表型，同时在体外验证产生差异表型可能的原因及下游信号通路，以期阐明C3a-C3aR轴在牙周炎发生发展中的作用及作用机制。 研究方法： 1.体内动物实验：利用基因型为C3ar+/+、C3ar+/-和C3ar-/-的基因敲除模式动物通过4-0的聚酰胺尼龙线结扎小鼠上颌左侧第二磨牙建立慢性牙周炎小鼠模型，以对侧同颌同名牙为自身对照，结扎11天后处死小鼠取材。采用Micro-CT三维重建观察牙槽骨吸收情况，HE染色观察牙周组织炎症细胞浸润、附着丧失、牙槽骨吸收状况，TRAP染色观察牙周组织破骨细胞数量，免疫组织化学染色检测炎症相关因子TNF-α、IL-1β水平。探讨C3a-C3aR轴在牙周炎发生发展中的具体作用。 2.体外细胞实验研究C3a对巨噬细胞的影响：利用巨噬细胞系RAW264.7与细菌脂多糖及人重组的C3a补体蛋白共培养，光学显微镜下观察C3a刺激后巨噬细胞的形态变化，实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞相关因子TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表达水平，免疫印迹实验检测TNF-α、IL-1β和iNOS的蛋白表达水平。酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清中细胞因子IL-1β和TNF-α的表达水平。蛋白免疫印迹实验检测C3a对巨噬细胞M1极化促进作用可能的下游信号通路NF-κB信号通路。细胞迁移实验检测补体C3a对巨噬细胞的趋化作用。 3.体外细胞实验研究C3a对成骨细胞、破骨细胞分化作用的影响：提取小鼠原代骨髓单核细胞及间充质干细胞，在C3a刺激下用M-CSF及RANKL进行破骨向分化诱导及利用成骨诱导液进行成骨诱导。抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞的数量，碱性磷酸酶染色观察成骨细胞的数量。 研究结果： 1.Micro-CT三维重建结果显示：与自身对照侧牙槽骨相比，3种不同基因型小鼠的牙周炎建模侧均发生不同程度的牙槽骨吸收，基因型为C3ar+/+的牙周炎小鼠与基因型为C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，牙槽骨破坏吸收无统计学差异；而与基因型为C3ar+/+和C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，基因型为C3ar-/-的小鼠牙槽骨吸收明显减少；HE染色结果显示：与自身对照侧牙周组织相比，3种基因型小鼠的牙周炎建模侧牙周组织中均有不同程度的炎性细胞浸润，附着丧失和牙槽骨丧失，基因型为C3ar+/+的牙周炎小鼠与基因型为C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，其炎性细胞浸润、附着丧失及牙槽骨吸收程度无明显差异，而与基因型为C3ar+/+、C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，基因型为C3ar-/-的小鼠牙周组织中炎性细胞浸润、附着丧失和牙槽骨吸收程度均有不同程度的减少；抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示：与自身未结扎侧相比，三种基因型小鼠的结扎侧牙周组织中TRAP阳性细胞数量均增多，基因型为C3ar+/+的牙周炎小鼠与基因型为C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，其结扎侧牙周组织中TRAP阳性细胞数量变化无统计学差异，而与基因型为C3ar+/+、C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，基因型为C3ar-/-的小鼠结扎侧牙周组织中TRAP阳性细胞数量明显减少；免疫组织化学染色结果显示：与自身未结扎侧相比，三种基因型小鼠的结扎侧牙周组织中炎症相关因子TNF-α和IL-1β的表达量均升高，基因型为C3ar+/+的牙周炎小鼠与基因型为C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，其结扎侧牙周组织中炎症相关因子表达水平变化无统计学差异，而与基因型为C3ar+/+、C3ar+/-的牙周炎小鼠相比，基因型为C3ar-/-的小鼠结扎侧牙周组织中炎症相关因子表达水平明显减少。 2.光学显微镜下观察结果显示：与空白对照组相比，LPS组、C3a组和LPS+C3a组巨噬细胞均伸出伪足，细胞形态表现为指状、树枝状和放射状等，其中LPS+C3a组比LPS组及C3a组表现更为明显，LPS组比C3a组表现更为明显，且LPS+C3a组细胞生长聚集，LPS组、C3a组和空白组细胞生长分散；RT-qPCR结果显示：与空白对照组相比，LPS组或C3a组以及LPS+C3a组均能促进巨噬细胞TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表达，但C3a组的作用效果明显弱于LPS组，而C3a+LPS组的TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表达水平均高于C3a组及LPS组；酶联免疫吸附实验结果显示：与空白对照组相比，LPS组或C3a组以及LPS+C3a组均能促进巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α、IL-1β，但C3a组的作用效果明显弱于LPS组，而C3a+LPS组的TNF-α、IL-1β的分泌量均高于C3a组及LPS组；蛋白免疫印迹实验结果显示：与空白对照组相比，LPS组或C3a组以及LPS+C3a组均能升高巨噬细胞中P-P65、P-ERK、TNF-α、IL-1β和iNOS的蛋白表达水平，但C3a组的作用明显弱于LPS组，而C3a+LPS组的P-P65、P-ERK、TNF-α、IL-1β和iNOS的蛋白表达水平均高于C3a组及LPS组。细胞迁移实验后进行DPAI核染色，结果显示补体C3a对巨噬细胞具有明显的趋化作用。 3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示：与C3a未处理组相比，不同浓度的C3a处理破骨细胞前体细胞均能增加破骨细胞分化。碱性磷酸酶染色结果显示：与C3a未处理组相比，不同浓度的C3a处理成骨细胞前体细胞均未能增加成骨细胞分化。 研究结论： 1.C3a-C3aR轴介导的信号能够促进牙周炎小鼠牙周组织炎症反应及牙槽骨丧失。 2.C3a能够趋化巨噬细胞并通过NF-κB信号通路促进巨噬细胞分泌炎症因子。 3.C3a能够促进破骨细胞分化，对成骨细胞分化无影响。
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