摘要
草甘膦（GLY）作为一种非选择性灭生性除草剂，以其残留低、杀草谱广和经济实惠的特点在全球范围内得到广泛使用，但GLY的滥用和残留药物的环境富集效应导致其对人类健康构成了严峻威胁。研究表明GLY具有多器官毒性，其中对雄性生殖器官的危害引起了公众的广泛关注。但现有研究仅从流行病学和模式动物的角度对GLY的雄性生殖毒性进行了初步报道，缺乏对导致雄性生殖毒性机制的深入系统性探究。鉴于此，本研究以大鼠为试验对象，采用体内外试验相结合的方法，以氧化应激为切入点，从GLY的生殖器官残留、肠道菌群紊乱、血睾屏障破坏和细胞自噬的角度，全面探究GLY雄性生殖毒性的作用机制。 1、GLY暴露对雄性大鼠生殖健康的影响 本试验选取108只4周龄SPF级（无特定病原体）SD雄性大鼠（体重112.4±6.7g），预饲1周后随机分为3组（对照组、低剂量组和高剂量组）。对照组饲喂商品饲料，低剂量组和高剂量组分别饲喂在商品饲料中添加终浓度为10mg/kg和250mg/kg GLY的饲料。各组动物自由采食和饮水。试验期为4个月，分别于试验第2个月和第4个月时每组选取18只大鼠采集血清和各脏器，研究GLY对大鼠生殖健康的影响。 与对照组相比，GLY处理组大鼠的平均日增重和脏器指数无明显变化，但是高剂量处理组大鼠的平均日粮消耗显著增多。采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS/MS）检测GLY暴露4个月的睾丸中GLY含量，其GLY含量分别为：0，0.002±0.001和0.016±0.006μg/g。GLY暴露2个月和4个月的睾丸和附睾病理学结果显示，低剂量组睾丸组织生精小管内各级生精细胞排列疏松，空泡化较多；高剂量组睾丸组织生精小管萎缩形变，生精管腔厚度变薄，间隙增大，各级生精细胞排列疏松，甚至脱落；两个暴露时间段的附睾组织无明显病变。采用计算机辅助精子分析仪（CASA）分析精子的相关参数，结果显示，GLY暴露2个月和4个月均导致大鼠精子质量下降，主要表现为精子的浓度下降，精子活力、快速前行精子和快速运动精子的比率降低。同时，GLY暴露引起大鼠血清中睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素和抑制素B水平显著下降，而雌激素水平显著上升。与对照组相比，睾丸中ROS水平和血清中MDA水平呈剂量依赖性升高，抗氧化酶T-AOC、SOD、CAT和GPx的水平显著下降。以上动物试验结果表明，GLY能改变性激素水平和诱导氧化损伤，导致精子质量下降，影响雄性生殖健康。 2、GLY诱导的肠道菌群紊乱致大鼠睾丸氧化损伤 GLY进入机体肠道（主要蓄积于小肠）干扰肠道菌群，这种肠道菌群的变化是否影响生殖健康，因此，本研究选用GLY暴露2个月的大鼠为研究对象，探讨GLY诱导的肠道菌群的变化对雄性生殖健康的影响。 首先，分别随机选取对照组和高剂量处理组5只大鼠小肠内容物进行了肠道菌群中16S rDNA基因扩增子测序，结果显示，GLY处理后大鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度显著下降，拟杆菌门和软壁菌门相对丰度显著上升；通过分析丰度大于1%的19个科水平中菌群的变化，显示GLY处理后大鼠肠道中拟杆菌门的普雷沃菌科和拟杆菌科增加最明显；属水平上，GLY处理后大鼠肠道中Lactobacillus和Enterorhabdus相对丰度显著下降，而Bacteroides和Prevotella_1相对丰度显著升高。Bacteroides和Prevotella_1的变化与精子质量的相关性分析表明，不论这两个属的总相对丰度还是任何单一菌属的相对丰度均与精子的活力和精子运动速率呈显著负相关。进一步研究证实这两个菌属增加刺激睾丸组织IL-17A的产生，激活睾丸组织IL-17A信号通路；IL-17A/TNF-α信号通路的活化又激活大鼠睾丸组织氧化损伤。综上所述，GLY引起特定肠道菌群失调激活睾丸中IL-17A信号通路，诱导睾丸组织氧化应激，最终导致精子质量下降。 3、GLY通过NOX1介导的氧化应激破坏大鼠血睾屏障 动物试验结果表明GLY诱导睾丸组织氧化损伤，为进一步探讨氧化应激在GLY致雄性生殖毒性中的作用，本研究选用GLY暴露4个月的大鼠和原代睾丸支持细胞为研究对象，阐明GLY诱导的氧化应激对大鼠血睾屏障的影响。 首先，通过生物素示踪法和透射电镜观察了大鼠血睾屏障的形态学，结果显示，GLY暴露4个月后生物素均能渗入生精小管；血睾屏障超微结构出现模糊和断裂；qPCR和免疫印迹试验结果进一步证实组成血睾屏障的关键基因（ZO-1，Occludin，Claudin1，Cx43，N-Cadherin和β-Catenin）以及相应蛋白表达水平显著下降，表明GLY破坏了血睾屏障。大鼠睾丸组织转录组学分析结果显示，GLY导致催化活性氧（ROS）产生的NOX1显著上调，预示GLY可能通过NOX1介导的氧化应激破坏血睾屏障。为了验证这一潜在机制，原代大鼠睾丸支持细胞经10μM GLY处理24h，结果显示GLY导致ROS水平显著上调，抗氧化酶SOD2、CAT和GPx1蛋白水平显著下调；ROS清除剂NAC（1mM）与GLY共处理能显著缓解GLY导致的ROS生成、抗氧化酶和血睾屏障关键蛋白水平的降低，证实GLY诱导的氧化应激是破坏血睾屏障的关键因素。在原代睾丸支持细胞暴露GLY过程中采用基因沉默技术对NOX1进行基因敲低，结果显示NOX1的下调能降低GLY诱导的细胞内ROS生成、恢复GLY导致的抗氧化酶相关蛋白水平的下降、改善GLY致血睾屏障关键蛋白的降低。最后，通过分子对接和荧光素酶报告实验证实GLY直接偶联到ER-α，与Pro399和Lys401形成4个氢键（结合能为-1.81kcal/mol），激活其转录活性，ER-α的激活介导NOX1显著上调。上述结果表明，GLY与ER-α直接结合，上调NOX1的表达而诱导氧化应激，导致大鼠血睾屏障的破坏。 4、GLY诱导的氧化应激导致大鼠睾丸组织自噬紊乱 前期研究发现，GLY能直接或间接作用睾丸支持细胞，诱导氧化应激。作为构成血睾屏障和调控精子生成的关键细胞，睾丸支持细胞的很多正常功能都涉及到自噬。因此，本研究选用GLY暴露4个月的大鼠和原代睾丸支持细胞为研究对象，探讨GLY诱导的氧化应激对大鼠睾丸组织自噬的影响。 首先，透射电镜结果显示GLY暴露诱导睾丸组织支持细胞中自噬小体生成和积累。体外试验证实GLY（10μM处理24h）引起原代大鼠睾丸支持细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅱ蛋白的显著增加和自噬小体的累积；同时，GLY激活原代睾丸支持细胞中的自噬流。随后，本研究又测定了溶酶体相关基因的变化，体内外试验结果显示GLY暴露均上调CTSB，CTSD，LAMP1和LAMP2的表达，表明GLY暴露增强了溶酶体的降解功能。最后，ROS清除剂NAC（1mM）与GLY共处理原代睾丸支持细胞，结果显示GLY诱导的自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达显著下降，溶酶体功能蛋白基因CTSB，CTSD，LAMP1和LAMP2表达显著下调。以上结果表明，GLY诱导的睾丸支持细胞氧化应激介导了自噬活化。 综上所述，本研究得出如下结论：（1）通过构建雄性大鼠GLY暴露模型，GLY既能引起肠道菌群变化，也能直接进入睾丸组织，影响生殖健康。（2）GLY诱导的特定肠道菌群失调与精子质量呈显著负相关。（3）GLY与ER-α直接结合并激活其转录活性，活化的ER-α上调NOX1表达，介导ROS积累，进而损伤血睾屏障。（4）GLY诱导的氧化应激介导了睾丸自噬流的增强。本研究阐明了GLY导致雄性生殖毒性的机制，为缓解和治疗GLY的雄性生殖毒性揭示了潜在的药物靶点，对于保障动物和人类生殖健康具有重要意义，为公共卫生健康提供了理论指导。
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