摘要
花青素属于黄酮类化合物，不仅具有重要的生理功能，而且具有多种生理活性。木质素是一种复杂酚类聚合物，在植物生物学中发挥着重要作用，其与花青素同属苯丙烷代谢途径分支产物。植物花青素和木质素的生物合成不仅涉及多个结构基因的参与，还受到多种转录因子的调控，其合成调控的分子机制还未揭示清晰。MYB（V-myb Avian Myeloblastosis Viral Oncogene Homolog）转录因子家族成员庞大，对植物体内花青素和木质素的合成具有重要的调控作用。本研究通过对不同发育时期桑椹的转录组差异分析发现，一种R2R3-MYB类转录因子基因MYB61的表达量与桑椹中类黄酮和花青素含量变化趋势呈负相关。因此，推测该转录因子可能对苯丙烷代谢途径具有一定的调控作用，同时也可能具有其它功能，但其具体的功能和作用机制还不清楚。本研究首次从桑树中克隆得到MYB61基因（MbMYB61），分析了其表达特性，并利用转基因技术研究了其生物学功能和调控机制；同时分析鉴定了MbMYB61基因的上游调控因子及其互作蛋白质，探讨了其作用机制。研究结果不仅为桑树育种提供了重要的基因资源，同时也为其它次生物质代谢调控机制研究提供了参考。 （1）花青素合成相关MYB基因的筛选。通过对不同发育时期桑椹的转录组差异分析发现，随着桑椹果实发育表达量持续上调的MYB基因有11个，表达量变化趋势与花青素含量变化趋势一致，持续下调的基因有49个，表达量变化趋势则与花青素含量变化趋势相反。其中，MbMYB61（CL5472）基因的表达趋势与花青素积累趋势相反。MbMYB61基因编码蛋白含有保守的R2和R3结构域，属于R2R3-MYB类转录因子。其结构中包含有一个bHLH（basic Helix-Loop-Helix）结合结构域和一个替代了SNDV结构域的负调控类黄酮合成的结构域DNEI。因此，推测MbMYB61可能对桑椹花青素合成具有负调控作用。 （2）MbMYB61基因的表达特性及MbMYB61蛋白的亚细胞定位分析。荧光定量PCR分析结果表明，MbMYB61基因在桑树各组织中均有表达，在青果期桑椹中表达量最高，红果期桑椹中次之，在叶和紫果期桑椹中表达最低。通过对MbMYB61的启动子（pMbMYB61）的核苷酸序列分析发现，pMbMYB61包含有多种激素和光响应元件等，利用烟草瞬时表达技术结合GUS组织染色发现，pMbMYB61具有ABA、GA、JA、光照诱导活性。亚细胞定位分析结果表明MbMYB61定位于细胞核内。 （3）MbMYB61基因的功能与调控机制分析。MbMYB61基因在拟南芥中过表达抑制了糖诱导的花青素的生物合成，减少了原花青素的积累。与野生型相比，转基因拟南芥中花青素合成途径中的结构基因DFR、ANS和UFGT的表达量显著降低，同时，原花青素合成途径的结构基因LAR的表达量也显著降低。烟草瞬时侵染和GUS组织染色检测结果表明，MbMYB61转录因子能够抑制ANS和LAR基因启动子的表达活性。另外，MbMYB61基因在拟南芥中过表达还降低了类黄酮的积累量，但提高了木质素的含量。与野生型相比，转MbMYB61基因拟南芥中木质素合成途径中的结构基因4CL、CCoAOMT和F5H基因的表达量显著增加。烟草瞬时侵染和GUS组织染色检测结果表明，MbMYB61转录因子能够增强CCoAOMT基因启动子的表达活性。 （4）调控MbMYB61基因表达的转录因子及MbMYB61相互作用蛋白的鉴定。利用PlantTFDB网站预测得到多个可能调控MbMYB61基因表达的转录因子，通过酵母单杂交实验证明MbMYB306能够与pMbMYB61启动子结合；利用STRING网站预测得到多个MbMYB61转录因子可能的互作蛋白，通过酵母双杂交实验及荧光素酶互补（LUC）实验证明了MbMYB61与MbNAC73之间存在相互作用。
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