摘要
中药红花为菊科植物红花（CarthamustinctoriusL.）的干燥管状花，具有活血通经、祛瘀止痛的功效。类黄酮是红花的主要活性成分，并且多以糖苷的形式存在。红花类黄酮糖苷的苷元类型多样，其中以查尔酮、黄酮、二氢黄酮、黄酮醇等类型最为多见。但是红花类黄酮糖苷的生物合成途径仍不明确，制约对红花品质形成机制的科学认识，也阻碍了利用现代分子技术进行资源开发利用。因而，红花糖基转移酶的筛选、克隆和功能鉴定具有重要的科学价值和应用意义。 大量研究报道光质是影响植物类黄酮合成代谢的关键因素，不同类型光质会造成类黄酮组分及基因的差异表达。因而，本论文首先分析了光质对红花类黄酮积累的影响。利用不同光质对红花进行处理，采用代谢组和转录组方法，筛选参与类黄酮合成，特别是糖苷类成分合成相关的糖基转移酶UGT基因。随后基于课题组已有全长转录组及二代转录组数据，采用同源克隆的方式，进一步对候选UGT基因进行克隆。最终共筛选克隆了8个候选UGT，并对其进行了功能鉴定。取得的主要结果如下： （1）利用广泛靶向代谢组分析了不同波长的光质对红花花期代谢物积累的影响，共检测到453个代谢物。将不同光质分别与白光、遮光条件进行比较，共得到158个显著差异的代谢物，其中包含了64个类黄酮成分，占到了差异代谢物总数的40.5%。64个差异代谢的类黄酮成分共注释到7种不同的类型，黄酮、黄烷醇（二氢黄酮醇）及黄酮醇类的差异代谢物最多，三者之和占到差异代谢类黄酮成分总数的81.25%。差异的类黄酮成分中有23个为糖苷类，约占差异类黄酮总数的36%，包括18个O-苷、5个C-苷，绝大多数苷元均为黄酮醇或黄酮结构。从KEGG通路注释与富集分析得出，不同类型的光质对红花代谢物的影响都以调控次生代谢生物合成为主，特别是类黄酮的生物合成、黄酮与黄酮醇的生物合成。代谢组分析结果表明，在红花花期时，不同的光质对红花次生代谢均有一定的影响，其中远红光与紫外光UV-B对代谢物的影响最大，特别是对类黄酮成分的合成代谢影响较大。 （2）对红花花期不同光质处理的16个样品的转录组测序分析，共获得121.17GbCleanData，Q30碱基百分比均在91%及以上，共得到差异表达基因1500个。与白光或遮光条件相比时，均为远红光、UV-B的差异最大。筛选出8个与类黄酮生物合成相关的差异表达基因，包括3个糖基转移酶基因CtUGT1、CtUGT2和CtUGT3。利用qRT-PCR验证了8个差异表达基因的相对表达。差异表达基因与差异代谢物的相关性分析得出，显著相关的差异基因与差异代谢物主要富集在次生代谢生物合成，特别是类黄酮生物合成。进一步筛选与类黄酮生物合成相关的差异表达基因与差异代谢的类黄酮成分，最终共得到9种类黄酮糖苷的含量分别与CtUGT1、CtUGT2、CtUGT3的表达量显著相关，且9种类黄酮糖苷以黄酮醇3-O苷或7-O苷为主。 （3）结合课题组以往的红花转录组数据，通过同源比对，又进一步筛选了5个红花UGT基因。成功克隆8个候选UGT基因的CDS全长序列，长度均在1400~1500bp范围。研究对候选UGT首先进行了生物信息学分析。通过蛋白的结构预测得出，CtUGT3、CtUGT6与CtUGT8可能以二聚体形式存在或发挥功能；CtUGT1与CtUGT8有结合尿苷二磷酸（UDP）配体的功能，CtUGT1与CtUGT8可能具有结合UDP葡萄糖的活性。通过UGT的进化分析可以看出，8个候选UGT均与（异）黄酮7-羟基糖基转移酶的亲缘关系较近，推测红花候选UGT可能具有将（异）黄酮7-OH糖基化的功能。 （4）对候选UGT基因进行了功能鉴定。成功诱导并纯化了5个红花UGT重组蛋白。选择了红花中常见的4种类黄酮苷元作为糖基化反应的受体底物，即柚皮素查尔酮（查尔酮）、柚皮素（二氢黄酮）、山柰酚（黄酮醇）与芹菜素（黄酮）。实验证明了CtUGT3可以催化柚皮素查尔酮、柚皮素、山柰酚以及芹菜素糖基化，分别生成柚皮素查尔酮-2’-O-葡萄糖苷、柚皮素7-O-葡萄糖苷、山柰酚3,7-二-O-葡萄糖苷以及芹菜素-7-O-葡萄糖苷。5个候选UGT均有一定的活性，而CtUGT3对4种不同类型的类黄酮苷元都有催化糖基化反应的作用，且活性相对更强。 （5）重点分析了CtUGT3的酶活特性，发现CtUGT3在20℃~60℃范围内均具有较高的活性；CtUGT3催化的糖基化反应在前5分钟最为剧烈；金属离子对CtUGT3活性影响不明显，仅有Co2+对其有一定的抑制作用；在pH8~9的磷酸盐或碳酸盐缓冲溶液中，CtUGT3活性相对更高。进一步对CtUGT3的酶动力学进行了探究，在以柚皮素为受体时，Km值为70.16μM；以芹菜素为受体时，Km值为75.46μM；以过量柚皮素为受体，不同浓度UDP葡萄糖的配体时，Km值为4.22μM；以山柰酚-7-O-葡萄糖苷为受体时，Km值为39.70μM。通过实验进一步证明了CtUGT3可以连续催化山柰酚两次糖基化反应，生成山柰酚-3,7-二-O-葡萄糖苷。在CtUGT3催化山柰酚生成山柰酚-3,7-二-O-葡萄糖苷的反应中，优先生成山柰酚-7-O-葡萄糖苷，然后在3-OH位再一次糖基化生成终产物。 （6）研究发现CtUGT3对4种不同类型的类黄酮苷元均有糖基化功能，且相对活性更高，因此针对CtUGT3进行了体内的功能研究。选用红花花冠制备原生质体，构建了pA7-CtUGT3-YFP瞬时表达载体，并成功转化在原生质体中。荧光显微镜观察发现转化CtUGT3后，红花花冠原生质体的颜色发生明显改变，通过高分辨质谱进一步分析转化CtUGT3后原生质体的类黄酮成分变化，发现有6个类黄酮或类黄酮糖苷成分的含量明显改变。相比于对照组，转化CtUGT3后的样本中新甘草苷（甘草素-7-O-葡萄糖苷）、(2S)-5,7-二羟基-6-甲氧基黄烷酮-7-O-β-D-吡喃葡糖的含量明显增加，同时山柰酚-3-O-β-芸香糖苷仅出现在转化CtUGT3后的样本中，证明CtUGT3在红花体内发挥了对7-OH、3-OH糖基化的功能。进一步证明了CtUGT3在红花类黄酮生物合成过程中起到重要的作用。 总结，本研究对花期不同光质条件的红花代谢组与转录组进行了分析，筛选了参与红花类黄酮糖苷生物合成的UGT基因，并对候选的UGT基因进行克隆及功能验证，证明了CtUGT3具有催化多种类黄酮苷元形成O-苷的活性，也是首次在植物中发现的二氧糖基转移酶（di-O-glycosyltransferases）。同时，实验中创新性的通过红花花冠原生质体验证了类黄酮合成功能基因的活性，也是首次结合体外与体内实验系统鉴定红花UGT基因的功能，最终证明了CtUGT3在红花类黄酮糖苷的生物合成中主要发挥了3-OH与7-OH糖基化的功能。本研究为解析红花有效成分生物合成途径、阐明红花品质形成的分子机制奠定了基础，也为糖基转移酶的合成生物学研究提供了新的分子材料。
NETL