摘要
构树（Broussonetiapapyrifera)是一种多功能树种，在造纸、医药、畜牧业和生态修复等方面具有较高的价值。然而，低温是限制构树分布及产量的重要非生物胁迫因素之一，尤其在中国的北方地区，这将对进一步探索如何满足人们对构树的需求提出了挑战。因此，研究构树响应低温胁迫的分子机理，提高构树的抗寒性，对构树产业的推广具有重要意义。植物中特有的LRR-RLK是一类跨膜蛋白，在植物的生长发育以及胁迫应答中起着信号的接收以及传递的作用。研究LRR-RLKs基因家族成员是否参与了构树低温胁迫响应是本论文拟解决的问题。本研究在构树中鉴定了LRR-RLK基因家族成员，分析了LRR-RLKs的基本特性以及表达模式，并开展了候选基因BpRLK1（Bp02g2188）基因的克隆以及功能初探。主要研究结果如下: (1)利用BlastP和HMMsearch两种方法结合的手段，从构树基因组中鉴定得到236个LRR-RLK成员。基于系统发育树分析，构树中的LRR-RLKs能够被分为21个亚家族。有223个LRR-RLK基因定位在了13条染色体上，其余13个分布到scaffolds上。串联重复事件和染色体片段复制事件是构树LRR-RLK基因家族扩张的重要方式。构树中LRR-RLK中重复基因对的Ka/Ks的比值均小于1，说明LRR-RLK家族的进化过程中受到了强的纯化作用。基因结构和蛋白保守motif分析结果表明，LRR-RLK在同一亚家族中的motif组成和基因结构相似，不同的亚家族中具有差异。BpLRR-RLKs的启动子区主要包含了与响应生物胁迫和非生物胁迫相关、调节植物的生长发育以及介导植物激素信号转导的元件。构树LRR-RLK基因具有组织表达特异性，说明LRR-RLK成员参与了植物的生长发育过程。通过对低温胁迫(4℃)下的转录组数据进行分析发现，超过一半的LRR-RLK成员的表达量在低温处理后有差异表达。 (2)通过RT-PCR的方法从构树叶片中克隆得到了BpRLK1，CDS全长为为2982bp，编码993个氨基酸。氨基酸的序列比对分析发现BpRLK1的结构非常保守。进化树分析证实，BpRLK1与桑树中MaRLK1的亲缘关系较近。对其表达模式探究发现，BpRLK1在茎中的表达量较高。在根中和叶中的表达量较低。低温处理后，BpRLK1在叶中的表达量于0.5h被迅速诱导上升，在1h后达到最高，随后表达量呈现下降的趋势但是仍高于未处理前的表达量;BpRLK1在茎的表达量几乎没有变化，在根中的表达量呈现出先下降后恢复到未处理前的水平。亚细胞定位结果表明BpRLK1定位在质膜上。利用同源重组的技术将BpRLK1的完整编码区接入pCAMBIA1300-BIPR载体上，通过农杆菌介导法将其转化杂交构树。 综上所述，本研究结合生物信息学分析以及转录组数据对构树中的LRR-RLK基因家族进行了系统的分析，表明构树LRR-RLK基因家族在植株响应低温的生物学进程中发挥着重要的作用。对候选基因BpRLK1的克隆与功能分析，不仅为该基因在响应低温信号通路的具体机制的研究奠定了重要的基础，还为构树新品种的研发提供了依据。
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