摘要
蛋鸡输卵管囊肿是危害养禽业的重要疫病，该病主要特征为:输卵管堵塞、干酪性输卵管炎，导致产蛋高峰期的鸡产蛋量及质量迅速下降，并伴随呼吸道、消化道疾病及干酪性输卵管典型病变特征等。引起该病的病原较多，其中传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus，IBV)和鸭源鸡杆菌（Gallibacteriumanatis，G.anatis）是比较常见的两种病原。鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒引起的疾病，主要造成鸡上呼吸道和下消化生殖道疾病，病理剖检可见气管和支气管水肿并有炎性渗出物、输卵管炎、输卵管囊肿及卵巢肿大。G.anatis感染鸡后也会造成呼吸道炎症、蛋鸡输卵管炎和输卵管囊肿。鉴于蛋鸡输卵管炎和输卵管囊肿，给养禽业带来的经济损失巨大，对该病的预防与控制显得越来越紧要，因此研究一款安全有效且免疫应激小的疫苗至关重要。目前，乳酸菌作为食品级的表达载体在研制活载体疫苗中被广泛的应用，乳酸菌能够黏附和定殖于黏膜部位，可刺激机体产生相应的免疫应答，而且乳酸菌作为食品级的表达载体制备口服疫苗在安全性等方面比其他弱毒活载体疫苗具有优势。基于以上原因，本试验以干酪乳酸杆菌作为递呈抗原的活菌载体，选择IBVS1、G.anatisGtxA-N和flfA基因作为目的基因，构建了单独表达G.anatisflfA基因的重组干酩乳酸杆菌和表达IBV-S1与G.anatis-GtxA-N-flfA重组菌表达系统，并对单基因重组干酪乳酸杆菌进行了免疫评价分析，重组菌系统构建为后期防治蛋鸡输卵管炎、输卵管囊肿和降低养禽业的风险奠定基础。 1.表达G.anatisFlfA蛋白重组干酪乳酸杆菌的构建及其免疫效果初步评价 以干酪乳酸杆菌CECT5276（L.caseiCECT5276）为宿主菌，选取G.anatis的flfA基因作为靶基因，将其克隆入穿梭表达载体pMG36e中得到重组质粒pMG36e-flfA。然后经PCR、酶切和测序验证正确的重组质粒电转入干酪乳酸杆菌中，筛选阳性克隆并进行PCR、酶切和测序验证，成功构建含有G.anatisflfA基因的重组干酪乳酸杆菌。将构建成功的重组菌用MRS培养基进行培养，以1％乳糖诱导后进行目的蛋白的诱导表达;重组菌中目的蛋白的表达及定位通过SDS-PAGE与WesternBlot进行鉴定，均可见约20.3kDa处有蛋白条带，与预期结果相符。结果表明G.anatisflfA基因在L.caseiCECT5276中成功获得表达。对重组菌的生物学特性分析显示，目的基因的插入对干酪乳酸杆菌生长无影响;其在宿主菌中可稳定遗传;模拟在动物体内的存留性能试验结果显示，重组菌在模拟肠液环境中、胃液环境中，在高盐环境中均有较好的耐受力;为检测重组菌对鸡免疫效果，将重组菌灌服1日龄受试雏鸡，每次连免3d，间隔2周免疫一次，共免3次。取免疫后第14、28、42d免疫鸡血清及肠道黏液测定特异性IgG和sIgA的抗体水平。结果显示，重组菌能诱导机体产生特异性IgG和sIgA抗体水平均高于空载体菌组和PBS对照组，差异显著（P＜0.05），说明重组菌能够刺激动物机体产生相应的免疫应答;动物攻毒试验结果显示，三组受试鸡均腹腔注射G.anatis12656-12菌株后均未见鸡死亡，但是免疫重组菌的鸡各脏器中的G.anatis的分离率均低于空载体组和PBS组，提示重组菌能够对鸡起到一定的免疫保护作用。本试验成功构建能够稳定表达G.anatis的FlfA蛋白的重组干酪乳酸杆菌L.casei5276/pMG36e-flfA，经口服免疫鸡可诱导其机体产生特异性免疫应答，此研究为G.anatis口服疫苗研究奠定基础。 2.表达IBVS1蛋白及G.anatisGtxA-N、FLFA蛋白重组菌的构建 以干酪乳酸杆菌CECT5276作为递呈抗原的宿主菌，选取传染性支气管炎病毒(IBV)的S1基因和鸭源鸡杆菌（G.anatis）的GtxA-N及flfA基因作为靶基因。首先构建重组质粒pMD18-T-S1、pMD18-T-GtxA-N和pMG36e-flfA，然后分别扩增目的基因，并将其进行重叠PCR得到融合基因S1-GtxA-N-flfA，最后将融合基因S1-GtxA-N-flfA与穿梭表达载体pMG36e进行无缝连接得到重组质粒pMG36e-S1-GtxA-N-FlfA;将上述经PCR和测序鉴定为阳性的重组质粒，电转化到L.caseiCECT5276中，挑取阳性克隆经鉴定，最终得到目的重组菌L.casei5276/pMG36e-S1-GtxA-N-FlfA。对重组菌进行生长状态、遗传稳定性分析，结果可得，重组干酪乳酸杆菌在14h内的生长状态和亲本菌相比并无明显变化，说明融合基因S1-GtxA-N-FlfA插入到受体菌后并未对其造成影响;重组菌连续传代培养20代后，每隔一代进行PCR检测可得，融合基因S1-GtxA-N-flfA可以在干酪乳酸杆菌中稳定遗传。本研究通过构建重组干酪乳酸杆菌，为进一步研究目的蛋白的抗原性及重组菌对动物免疫保护试验的研究奠定基础。
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