摘要
水稻种子的休眠和萌发是一个由主效基因+多个微效基因共同控制的复杂而重要的农艺性状，涉及到许多生理过程和能量代谢途径。水稻的休眠性过高，会导致田间出苗低且不整齐，不利于直播栽培群体的生长。而水稻休眠性过低，成熟期阴雨天气极易造成穗发芽现象，导致水稻产量和品质下降，严重影响种子的种用价值。因此，深入研究水稻种子休眠的分子机制及培育适度休眠的水稻品种具有十分重要的意义。本研究针对水稻种子的休眠性，开展以下两个控制种子休眠基因的研究，第一部分是水稻种子休眠基因Sdr4的功能研究;第二部分是水稻休眠突变体h470的基因克隆及功能分析。 第一部分:Sdr4(Seeddormancy4)是一个水稻胚中特有的调控种子休眠的基因，前人仅图位克隆了该基因，但该基因编码未知功能蛋白，对种子休眠的调控机制也未作研究。本研究对Sdr4的功能进行了更为深入的探索，主要结果如下: 1.在强休眠的籼稻品种N22中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得敲除Sdr4的转基因材料cr-sdr4，有两种敲除的基因型，均造成了蛋白翻译的提前终止。和野生型相比，cr-sdr4的休眠性基本丧失，并且胚显著变大，α-淀粉酶活性显著升高。 2.相比野生型，cr-sdr4对低浓度的外源ABA不敏感。ABA代谢相关基因的表达显著降低，导致其内源ABA的含量显著升高。 3.Sdr4的氨基酸序列和同源蛋白进化树分析，表明其不合有已知的结构域并且与近缘物种的保守性较低。亚细胞定位结果显示Sdr4位于细胞核中，而转录激活实验表明，Sdr4不具备转录活性，可能不是一个转录因子。 4.进一步对已报道的休眠相关基因的表达进行鉴定，发现在cr-sdr4中，VP1(viviparous1，即ABI3转录因子，参与ABA信号通路)基因的表达水平显著降低。对Sdr4的2Kb启动子区分析，发现其含有七个ABRE元件，该元件为VP1的结合元件。利用CRISPR/Cas9技术将VP1敲除获得了转基因材料cr-vp1，其表型同cr-sdr4一致，休眠性均大大降低。 5.利用酵母单杂和荧光素酶实验(luciferaseassay，LUC)实验，证明VP1确实能够结合到Sdr4的2Kb全长启动子，特别是结合到2Kb启动子中的特定区段，即P1和P6区段，并且正调控Sdr4的表达。 6.酵母文库的筛选找到一个可能与Sdr4互作的蛋白，为OsERF2（ethyleneresponsefactor2，是乙烯信号通路的下游组分）。利用酵母双杂实验证实了Sdr4与OsERF2的互作。前人研究表明，OsERF2的表达水平和糖含量成正相关。我们推测Sdr4可能通过与OsERF2互作，去调控种子内部能量和糖类物质的积累，影响种子休眠。 第二部分:对突变体h470研究的主要结果如下: 1.从400Gy60Co辐射诱变N22的群体中筛选到一个弱休眠的突变体h470，其休眠水平显著降低。种子发育和贮藏的不同时期，h470的发芽率均明显高于野生型。 2.相比野生型，h470对外源GA和ABA的敏感性均无显著差异。h470内源的GA4和ABA含量均有显著的提高，并且相关基因的表达水平也与这一结果相吻合。 3.利用N22和h470构建正反交的F2群体，选取群体中高发芽和低发芽的单株各30株，进行mut-map全基因组的测序，结果发现在第2号染色体Os02g0202400基因上有一个T碱基的缺失。结合生物信息学和NCBI等数据库网站的分析，Os02g0202400编码一个含425个氨基酸的ADP-葡萄糖转运蛋白，注释为OsBT1。突变位点位于第一个外显子上，并造成了蛋白翻译的提前终止。结合转基因互补、RNA干扰及等位突变体osbt1材料的发芽实验，均证明OsBT1的突变是导致突变体h470种子休眠性减弱的原因，显示出高发芽的表型。 4.在h470中，对一些休眠相关基因的表达进行分析，发现α-淀粉酶相关基因的表达水平有显著升高。对h470的α-淀粉酶活性测定，结果显示α-淀粉酶活性也显著升高。 5.OsBT1本身是一个ADP-葡萄糖转运蛋白，影响种子中的淀粉合成。所以，通过代谢组的分析及h470种子内淀粉、可溶性糖和葡萄糖含量的测定，发现h470中淀粉含量显著下降，而可溶性糖和葡萄糖的含量显著升高，推测OsBT1是通过影响糖代谢来调控种子休眠。
NETL