摘要
乳腺癌是发生在乳腺组织的恶性肿瘤。癌症的转移是造成死亡率高的原因，而乳腺癌极容易出现转移。在肿瘤的浸润性生长中，尤其是在上皮癌，肿瘤细胞往往是以多细胞共同迁移的方式进行，即肿瘤细胞的群体迁移。而肿瘤细胞迁移这一运动受到很多蛋白信号网络的调控，研究发现在单细胞迁移过程中，细胞骨架会不断地变化重组。与单细胞迁移不同的是，在细胞进行群体迁移的进程中，细胞与细胞间的连接还会共享迁移群体的信号处理和力传递。在细胞内还存在高保守的Notch家族信号通路，它对肿瘤的发生发展有着密切的关系，对肿瘤的浸润转移过程中也有着至关重要的作用。已有研究发现Notch-1的活化能调节肿瘤细胞的个体迁移。然而Notch-1通路是否能调节乳腺癌细胞群体迁移及其机制还尚不明确。因此本课题主要探究Notch-1活化对于肿瘤细胞群体迁移的作用以及Notch-1具体通过哪些途径调控肿瘤细胞群体迁移。 本课题选择能够进行群体迁移的乳腺癌细胞(MCF-7)作为研究的细胞系，并且利用细胞稳定转染的技术构建出Notch-1活化程度不同的细胞株，探究Notch-1的活化水平是否能通过调节细胞骨架和细胞间连接进而调控肿瘤细胞的迁移能力，并且揭示其调控群体迁移的具体分子机制。本文首先通过蛋白免疫印迹实验验证四组稳转细胞系构建成功，进而进行后续实验。使用延时摄影技术发现伤口愈合实验过程中Notch-1活化抑制了肿瘤细胞群体迁移的效率，而沉默Notch-1得到了相反的结果。为了找到造成这样现象的原因，我们首先探究Notch-1活化对细胞间连接的影响。选择E-cadherin作为标志，通过免疫荧光染色可以发现Notch-1活化会增加细胞的E-cadherin表达量，并对E-cadherin的侧面分布并无影响，表明Notch-1活化后胞间连接最紧密。找到能够调节E-cadherin的ILK/GSK-3β/β-catenin通路，根据免疫荧光和WesternBlot可得知，Notch-1活化通过抑制ILK的活化，导致GSK-3β具有活性，胞质内游离的β-catenin被GSK-3β复合物降解无法入核下调E-cadherin的表达，E-cadherin表达相对而言会增加，细胞间连接更为紧密。而膜上与E-cadherin相连的β-catenin不会被GSK-3β复合物降解，它的变化趋势与E-cadherin保持一致。接下来研究Notch-1活化对细胞骨架的调节，选择最经典的RhoA-ROCK通路，根据免疫荧光和WesternBlot发现Notch-1活化导致其Rho-ROCK通路的激活。免疫荧光显示，Notch-1活化会形成更多的应力纤维，使骨架更为稳定。且Notch-1活化后，活性状态下的MYPT1减少，抑制肌球蛋白磷酸酶活性，导致肌球蛋白轻链磷酸化程度增加，细胞收缩力变大。已经探究了细胞胞间连接和胞内骨架的变化，细胞与外部环境，比如与基底的粘附也会影响细胞的群体迁移。对Paxillin进行荧光染色，并对黏着斑的数量和面积进行统计，可知Notch-1活化后黏着斑数量最多，面积最大，粘附力最强。 综上所述，本课题发现Notch-1活化通过抑制ILK的活化，激活了GSK-3β，使胞质内游离的β-catenin被GSK-3β复合物降解不能入核去下调E-cadherin表达，使E-cadherin表达量更高，细胞间连接更为紧密，膜上与E-cadherin相连的β-catenin不会被GSK-3β复合物降解，它的变化趋势与E-cadherin保持一致。并且激活RhoA-ROCK通路，F-actin重组聚合，肌球蛋白发生收缩。另一方面，Notch-1活化后，细胞与细胞外基底粘附力增强，抑制了细胞的迁移。Notch-1活化从两方面共同抑制了肿瘤细胞的群体迁移。本研究所发现的Notch-1通路通过细胞骨架和胞间连接调控肿瘤细胞群体迁移的分子机制为乳腺癌的研究提供了新的治疗靶点。
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