摘要
目的：本文通过体外诱导M2型巨噬细胞模型成功后，用雷公藤甲素（TP）进行干预，探究TP是否对M2型巨噬细胞有特异性抑制生长的作用，通过多种实验技术手段评价TP对M2型巨噬细胞极化的影响，并用PCRARRAY进行了TP促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化的机制研究，为TP在临床肿瘤治疗中的应用提供新的思路。方法：（1）建立BALB/C裸鼠A549腋下皮下成瘤模型，待肿瘤直径在5mm左右随机分为溶剂对照组和药物干预组，干预方式为瘤周皮下注射，干预时间为5天，5天后脱臼法处死小鼠，再分组拍照肿瘤的大小变化。（2）手术剖离瘤体，剪碎，消化为单细胞悬液，用流式细胞仪检测F4/80+CD206+和F4/80+CD16/32+双阳细胞群比例。（3）通过细胞实验诱导M0-U937，M1-U937，M2-U937细胞成功后，加TP干预24h后，用CCK-8法考察TP对U937细胞，M0-U937细胞，M1-U937细胞，M2-U937细胞四种细胞生长的影响。（4）采用流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面标志性蛋白CD163，M1型巨噬细胞标志性蛋白CD86以及巨噬细胞标志性蛋白的表达变化。（5）用q-PCR方法检测巨噬细胞M2型或M1型标志基因的mRNA水平。（6）转染Si-SPTLC3或SPTLC3目标质粒后的巨噬细胞，收集IL-4或TP单独或共同孵育的条件培养基，ELISA试剂盒检测培养基中M1型巨噬细胞，M2型巨噬细胞标志性细胞因子。（7）WesternBlot的方法验证转染是否成功，并检测转染Si-SPTLC3和SPTLC3质粒后，M2型巨噬细胞表达M1型标志蛋白CD86和M2型巨噬细胞标志物CD163蛋白的表达情况。（8）探讨M2-U937细胞上调或下调SPTLC3蛋白对共培养体系中A549细胞侵袭能力的影响。结果：（1）每天用游标卡尺测量小鼠瘤体长轴a和短轴b的长度，并用VTumor=1/2×a×b2计算瘤体体积，发现TP可显著抑制BALB/C裸鼠A549细胞腋下皮下成瘤瘤体体积，通过流式细胞仪检测发现TP可显著减少BALB/C瘤体组织中F4/80+CD206+细胞群比例，增加F4/80+CD16/32+细胞群比例。（2）TP可特异性杀伤M2型巨噬细胞，与U937细胞，M0-U937细胞，M1-U937细胞相比，40nMTP时M2-U937细胞抑制率能达到55.66±0.13%，因此考虑40nM为后续实验的最佳实验浓度。（3）TP能促进M2型巨噬细胞向M1型极化，通过流式细胞术检测发现IL-4能显著增加CD163阳性细胞的比例，从1.12±0.07%至38.1±0.11%（P＜0.01）。另一方面我们采用LPS刺激M2-U937细胞，通过流式细胞术考察巨噬细胞表面M1型标志性蛋白水平，结果表明LPS能显著细胞上调CD86阳性细胞比例，从4.95±0.08%至26.53＋0.07％（p＜0.001）且与对照组相比具有显著性差异（p＜0.001）。（4）通过WesternBlot检测CD86和SPTLC3蛋白，结果显示随TP浓度上升（10nM，20nM，40nM），SPTLC3蛋白呈下降趋势，CD86蛋白呈上调趋势。（5）在M2-U937细胞瞬时转染实验中，WesternBlot检测也发现，与NC组相比，转染Si-SPTLC3的细胞表达CD86更高；与空载质粒组相比，转染SPTLC3质粒的细胞表达CD86降低，P＜0.01，有统计学差异。（6）在M2-U937细胞通过上调或下调SPTLC3蛋白对共培养体系中A549细胞侵袭能力实验发现TP可能通过下调M2-U937的SPTLC3蛋白使M2-U937逆转为M1-U937，进而抑制A549细胞的侵袭能力。结论：体内实验证实，TP可以明显抑制BALB/C裸鼠A549腋下皮下成瘤瘤体体积，TP可以明显减少BCLB/C裸鼠瘤体组织内F4/80+CD206+细胞群的比例，增多F4/80+CD16/32+细胞群的比例，且差异具有统计学意义；体外实验证实，TP能特异性杀伤M2型巨噬细胞；TP可促进M2型巨噬细胞向M1型极化，且这种促进M1型巨噬细胞极化的作用可能是通过降低SPTLC3蛋白表达来实现的，同时TP可能通过下调M2-U937的SPTLC3蛋白使M2-U937逆转为M1-U937，进而抑制A549细胞侵袭能力。
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