摘要
背景:弓形虫表面抗原SAG1参与虫株感染过程，而关于SAG1如何参与该过程目前尚不明确。 细胞凋亡作为细胞程序性死亡的一种方式，对于维持机体稳态发挥重要的作用。研究显示胞内寄生性原虫刚地弓形虫能够通过多种路径抑制或促进宿主细胞凋亡从而成功实现胞内寄生或释放至胞外，目前关于虫株毒力因子调控宿主细胞凋亡作用机制复杂且呈多样性。 方法:使用crispr-cas9方法构建SAG1敲除株，使用RH野生株，RH-ΔSAG1株分别感染HFF细胞，检测SAG1对于虫株黏附，入侵以及增殖影响;Balb/c小鼠腹腔注射103RH，RH-ΔSAG1虫株观察小鼠生存时间差异;使用非同源重组方法构建RH-SAG1-BioID2-HA，RH-SAG1-TurboID-HA标签虫株，分别感染HFF细胞，细胞培养基中加入160μMD-Biotin标记可能与SAG1互作的蛋白，收集细胞裂解产物，将使用streptavidin磁珠纯化后的免疫沉淀产物进行质谱检测，通过对质谱检测结果进行进一步生物信息学分析筛选感兴趣宿主细胞蛋白，通过免疫荧光检测该宿主蛋白在虫株入侵过程中定位，使用siRNA敲低该宿主细胞蛋白表达检测该蛋白对调控弓形虫黏附，入侵以及增殖影响。 使用弓形虫强毒株RH株，中等毒力毒株ME49以及无毒株VEG分别感染RAW264.7，THP-1，SF268细胞2h或22h，采用细胞凋亡诱导剂ATP分别处理细胞4h或6h，采用流式细胞术以及TUNEL检测不同处理组间宿主细胞凋亡情况。使用RH野生株，RH-Δrop18株分别感染上述三种细胞10h，采用ATP诱导细胞凋亡14h，并采用流式细胞术检测不同处理组间细胞凋亡情况。采用蛋白质免疫印迹检测三种细胞促细胞凋亡蛋白P2X1表达情况，采用荧光共振能量转移(FRET)以及免疫共沉淀(CO-IP)技术检测宿主促细胞凋亡蛋白P2X1与TgROP18的互作以及互作结构域。采用流式细胞术检测TgROP18是否调控P2X1介导的宿主细胞凋亡。同时使用正置荧光显微镜联合流式细胞术检测在凋亡诱导剂ATP处理条件下RH株，RH-Δrop18株感染的SF268细胞线粒体膜去极化情况，使用细胞质与线粒体分离试剂盒联合蛋白质免疫印迹检测RH野生株，RH-Δrop18株感染SF268细胞凋亡相关蛋白细胞色素C，Bcl2以及Bax转位情况，半胱天冬氨酸酶(caspase)活化情况，从而检测TgROP18调控SF268细胞凋亡的具体作用方式。 结果:SAG1敲除虫株对于宿主细胞黏附以及入侵率显著低于野生株，而对虫株在胞内增殖无明显影响;Balb/c小鼠腹腔注射RH野生株小鼠感染第7天全部死亡，而感染RH-ΔSAG1小鼠在第10天全部死亡;蛋白质免疫印迹联合间接免疫荧光检测结果发现RH-SAG1-TurboID-HA，RH-SAG1-BioID2-HA虫株感染的HFF细胞在含有D-Biotin的培养基中均能富集到SAG1互作候选蛋白，且SAG1-TurboID比SAG1-BioID2具有更强的生物酶活性，因此能够富集到更多SAG1互作候选蛋白。质谱分析结果显示RH-SAG1-TurboID-HA虫株感染HFF细胞SAG1互作候选蛋白有119个。RH-SAG1-BioID2-HA虫株感染HFF细胞后有72个SAG1互作候选蛋白，两种虫株分别感染宿主细胞后均筛选到的SAG1互作蛋白有25个;选取感兴趣的宿主细胞蛋白S100A6，ANXA6，DPP4，CKAP4，ITIGB1，MYH9作为我们候选互作靶标，结果发现当RH株黏附在宿主细胞表面时，S100A6，ANXA6蛋白与SAG1存在共定位现象，而宿主DPP4能够聚集在SAG1周围，而当RH株入侵宿主细胞后，S100A6，ANXA6，DPP4蛋白等均能聚集到纳虫泡膜周围;siRNA敲低S100A6，ANXA6蛋白表达:虫株黏附，入侵宿主细胞效率及在胞内增殖效率显著降低，S100A6，ANXA6蛋白表达水平的降低导致细胞骨架纤维丝排列受阻，可能是导致虫株感染率下降的主要原因;siRNA敲低DPP4蛋白表达后发现:虫株黏附，入侵效率显著降低，而增殖效率与未敲低组相比无明显统计学差异。不同毒力虫株分别感染宿主细胞不同时间后，均能抑制由ATP诱导的THP-1，SF268及RAW264.7细胞凋亡。以SF268为细胞模型，ATP作为凋亡诱导剂时，RH-Δrop18感染组细胞凋亡率显著高于RH野生株感染组;而以THP-1以及RAW264.7为细胞模型，ATP作为凋亡诱导剂时，RH-Δrop18感染组细胞凋亡率与RH野生株感染组细胞凋亡率无明显差异;P2X1在SF268细胞中表达，而在THP-1及RAW264.7细胞中不表达。TgROP18能够与促细胞凋亡蛋白P2X1的C末端结合，能够抑制P2X1介导的SF268细胞凋亡;TgROP18能够抑制P2X1介导的宿主细胞钙离子内流，同时还能够抑制ATP诱导的SF268细胞线粒体膜去极化，线粒体内细胞色素C向细胞质转位，促进细胞质内Bcl2向线粒体转位，同时抑制活化形式caspase表达。 结论:表面抗原SAG1调控虫株对于宿主细胞黏附以及入侵，而对虫株在细胞内增殖以及毒力无影响，同时该抗原依赖于宿主细胞S100A6，ANXA6，DPP4从而成功实现黏附以及入侵;S100A6，ANXA6蛋白表达降低后同时可影响虫株在宿主细胞内的增殖;不同毒力虫株感染均能抑制THP-1，SF268，RAW264.7细胞凋亡，弓形虫强毒株毒力因子TgROP18能够通过靶定宿主细胞P2X1的C末端抑制由ATP诱导的SF268细胞线粒体路径凋亡。
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