摘要
油菜作为世界四大油料作物之一，不仅是食用植物油主要来源，也是饲用蛋白重要来源，还可作为生物柴油理想原料。提高种子含油量、改变油脂脂肪酸构成是油菜遗传育种的重要目标。二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1)催化Kennedy途径的限速酶，对于提高含油量具有重要作用。油酸去饱和酶基因(FAD2)用于遗传调控油脂的构成。本研究克隆了油菜BnDGAT1基因和BnFAD2基因，开展遗传转化，为提高含油量以及改变油菜种子脂肪酸构成研究，获得了新材料。主要研究结果见下: 1.二酰甘油酰基转移酶基因BnDGAT1的遗传转化:(1)基因克隆:甘蓝型油菜中有3个DGAT1基因拷贝。从甘蓝型油菜中双11号中克隆得到BnDGAT1-1基因，作功能分析和遗传转化，该基因结构上含16个外显子、15个内含子，具有二酰甘油酰基转移酶的功能域特征。(2)BnDGAT1-1的遗传转化结果:本研究用种子特异性启动子Napin替换CaMV35S启动子，构建种子特异性驱动的DGAT1基因过表达载体，以中双11号和南农9808为受体，分别获得4个和3个转基因系。转化株后代角果的BnDGAT1-1基因表达量显著提升，种子含油量提高2-8％。 2.油酸去饱和酶基因BnFAD2(BnC05g40970D)的遗传转化:(1)基因克隆:从甘蓝型油菜中双11号中克隆BnFAD2基因(BnC05g40970D)，该基因含3个外显子、2个内含子，ORF长度为1154bp，具有脂肪酸去饱和酶的功能域特征。(2)过表达载体构建及遗传转化结果:用种子特异性启动子Napin替换载体上CaMV35S启动子，构建过表达载体。以双低品种中双11号和南农9808为受体，采用农杆菌介导方法转化，分别收获2个和5个转基因系。转化株角果BnFAD2基因表达水平提高了1-4倍。 3.BnFAD2基因编辑:(1)基因编辑载体构建:选择该基因保守区域设计两个靶点:靶点1(TargeSpot1，TS1)与靶点2(TargeSpot2，TS2)，靶点相距约220bp。TS1和TS2的GC％值分别为60％和55％，利于编辑。TS1选AtU3b启动子、TS2选AtU3d启动子构建sgRNA表达盒。(2)遗传转化:以中双11号、南农9808和品系CE001为受体，利用Cas9p序列，设计特异性引物，检测后分别获得5、5和4个转基因株。（3)编辑株鉴定:根据基因组序列，设计BnA05g26900D和BnC05g40970D靶基因特异性引物，扩增基因组序列，在品系CE001上得到4个BnFAD2编辑株。
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