摘要
研究背景 口腔鳞状细胞癌（oralsquamouscellcarcinoma，OSCC）是头颈颌面部常见的恶性肿瘤之一，在亚洲地区发病率较高。大多数OSCC患者在诊断时已处于疾病晚期。虽然手术、放疗以及化疗等综合治疗手段取得了一定进展，但OSCC患者5年生存率仍然维持在50％左右，且25％-50％的患者会出现局部复发及远处转移。西妥昔单抗作为OSCC的靶向治疗药物，与传统化疗药物联用可以提高肿瘤治疗效果，但患者的总体应答率不佳。最近，免疫检查点阻断剂已被批准用于治疗晚期和转移型头颈部鳞状细胞癌(headandnecksquamouscellcarcinoma，HNSCC)患者，以改善预后。然而临床试验结果显示患者客观应答率较差，可能是肿瘤微环境中存在的CD8+T细胞不足导致。因此，阐明OSCC发生发展的分子机制，鉴定高效的治疗应答及预后生物标志物，探索新的治疗靶点十分必要。 海量组学数据的产生使得数据驱动式研究成为可能。高通量测序技术以及生物信息学方法作为一种重要的工具，已经应用于肿瘤研究和临床治疗的各个方面，包括肿瘤异质性、肿瘤耐药性、肿瘤免疫微环境、肿瘤新抗原的表征识别以及生物标志物的发现。通过对来自不同独立队列的大量临床样本数据进行挖掘和探索，研究者能够在分子水平上理解肿瘤的发生发展规律。本研究目的在于，基于数据驱动的研究范式: （一）探究OSCC发生发展的分子新机制，寻找潜在治疗靶点; （二）探究OSCC与肿瘤微环境的相互关系; （三）寻找OSCC免疫治疗应答及预后生物标志物。 第一部分组蛋白赖氨酸甲基转移酶SMYD3通过转录增强HMGA2表达介导口腔鳞状细胞癌发生机制的研究 肿瘤发生涉及到发育程序的重新获取，产生具有无限增殖、自我更新潜力的细胞。在这个过程中，除遗传水平变异之外，表观遗传失调带来的影响不可忽视。染色质调节因子可以动态调控染色质结构，以表观遗传的方式影响基因表达，从而响应细胞内外的信号传递。这些调节因子的异常改变可能会重新编码染色质表观基因组图景，进而导致肿瘤的发生。因此，探究OSCC发生发展过程中异常改变的染色质调节因子及其作用机制，可以为制定有效的OSCC诊疗策略提供理论支撑。我们利用机器学习等方法，通过数据筛选429个染色质调节因子，发现组蛋白赖氨酸甲基转移酶SMYD3在OSCC中显著高表达，且其过表达与患者不良预后有关。SMYD3属于组蛋白甲基转移酶家族，影响组蛋白与非组蛋白的甲基化水平，调控基因转录与蛋白功能，在肿瘤发生发展中起着重要作用。然而，SMYD3在OSCC发生过程中的生物学功能及调控机制仍未阐明。 研究目的 1.探究SMYD3在OSCC中表达改变及其临床意义; 2.解析SMYD3促进OSCC发生及恶性增殖的分子调控机制; 3.揭示SMYD3靶向抑制剂BCI-121在OSCC治疗中的临床转化价值。 方法与结果 1.SMYD3被鉴定为0SCC核心基因且其高表达提示患者预后不良 我们对数据库中OSCC与癌旁组织进行基因表达差异分析，得到差异表达的染色质调节因子。通过Lassologisticregression与Boruta机器学习算法，明确与肿瘤发生密切相关的染色质调节因子。单因素、多因素Cox回归分析以及随机生存森林结果显示SMYD3对患者生存结局影响最大。接着，我们在不同数据集中使用K-M生存曲线进行探究，发现SMYD3高表达与OSCC患者生存时间较短相关。因此，SMYD3被鉴定为本研究的目标基因。 2.SMYD3在OSCC中表达上调且与肿瘤恶性程度相关 通过公共数据库与收集的临床样本进行生物信息学分析、实时定量PCR(real-timequantificationpolymerasechainreaction,RT-qPCR)、Westernblotting、免疫组织化学染色，发现对比癌旁组织，肿瘤组织中SMYD3异常高表达，随着肿瘤恶性程度增加，SMYD3表达逐步上调。并且，SMYD3在男性患者、具有吸烟饮酒史患者、肿瘤分级分期较高、TP53突变型、经典上皮亚型、低甲基化亚型OSCC组织中往往表达更高。此外，OSCC中，SMYD3拷贝数往往发生扩增。免疫荧光实验结果表明SMYD3主要分布于OSCC细胞核与细胞质内。 3.SMYD3与OSCC干性维持及细胞增殖相关 我们利用单细胞测序数据以及ssGSEA算法，发现在细胞水平以及组织水平中，SMYD3表达与干性评分及增殖评分呈正相关。随后，我们对CAL-27细胞转染NC组与SMYD3siRNA组进行RNA-seq测序，对两组样本进行基因表达差异分析，并对获得的差异表达基因进行GO与KEGG分析，结果显示其主要富集于基因转录调控、细胞分化、细胞增殖调控、干细胞分化、细胞生长因子、细胞转移、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)和肿瘤相关的信号通路中。最后，利用GSEA算法对RNA-seq测序所得数据再次进行细胞功能与通路验证。 4.SMYD3促进OSCC干性维持与细胞增殖 干性成球实验结果显示，SMYD3干扰显著损害了肿瘤干性球形成能力。克隆形成及EdU实验结果发现，SMYD3干扰抑制了OSCC细胞增殖。Westernblotting实验表明SMYD3缺失降低了c-MYC、BMI1与NANOG等肿瘤干细胞标志物以及CCND1表达。此外，我们发现SMYD3表达降低可以抑制H3K4me3水平，而过表达SMYD3可以促进OSCC细胞干性成球及细胞增殖能力。将稳定转染CAL-27细胞系注射至裸鼠背部两侧皮下构建皮下成瘤模型，结果显示SMYD3干扰可削弱小鼠肿瘤形成能力并抑制肿瘤的重量与体积。免疫组织化学染色表明，SMYD3干扰组小鼠肿瘤组织中增殖相关分子Ki67蛋白表达降低。 5.SMYD3靶向抑制剂BCI-121可阻遏OSCC细胞生长与增殖 在OSCC细胞内，SMYD3的抑制剂BCI-121能够抑制SMYD3甲基转移酶活性，而不改变其表达水平。体外实验结果显示，BCI-121能够显著抑制OSCC细胞干性维持、生长与增殖，并且降低c-MYC、BMI1与NANOG等肿瘤干细胞标志物以及CCND1表达。裸鼠瘤内注射BCI-121可有效遏制体内OSCC肿瘤细胞生长与Ki67蛋白水平。 6.HMGA2是SMYD3介导功能的潜在关键效应分子 通过ChIP-seq测序、自组织映射神经网络、蛋白质互相网络构建以及MCODE算法，最终确定了3个潜在的可被SMYD3直接调控基因;HMGA2、CCND1和SNAI1。通过相关性分析，我们发现在OSCC以及泛癌中，SMYD3与HMGA2呈共表达关系。因此，我们推测HMGA2是SMYD3介导功能的潜在效应分子。 7.HMGA2在OSCC中高表达且与患者预后不良相关 Meta-GEO数据集分析结果显示，与正常组织相比，HMGA2在肿瘤组织中表达显著上调。K-M生存曲线结果显示，HMGA2高表达患者相较于低表达患者预后差。我们对收集的临床样本通过RT-qPCR、Westernblotting以及免疫组织化学染色检测HMGA2表达情况，结果证实HMGA2在肿瘤组织中过表达，且表达水平随着OSCC恶性化程度升高而增加。此外，SMYD3与HMGA2在RNA水平以及蛋白水平呈正相关性。免疫荧光实验证实HMGA2在OSCC细胞中的核内定位。 8.SMYD3通过增加启动子区H3K4me3修饰促进HMAG2转录表达 SMYD3干扰可以明显抑制HMGA2的RNA水平和蛋白水平表达，而过表达SMYD3可以促进HMGA2表达。同样，加入BCI-121抑制剂后，HMGA2表达受到遏制。随后，我们通过ChIP-qPCR以及双荧光素酶报告实验，证实SMYD3通过影响HMGA2启动子区组蛋白赖氨酸甲基化水平调节其表达。挽救实验表明，HMGA2抑制可以逆转SMYD3对OSCC细胞干性成球的促进作用。 结论和意义 在本研究中，我们利用生物信息学、机器学习和生物学实验等多维度研究方法，发现染色质调节因子SMYD3在OSCC中高表达，促进肿瘤干性维持及细胞增殖，与患者不良预后相关。此外，SMYD3在OSCC中通过组蛋白甲基化修饰转录调控HMGA2表达，促进肿瘤发生，其靶向抑制剂BCI-121能够有效抑制细胞成瘤性，具有潜在临床应用前景。本研究为进一步阐明OSCC发生的分子机制，寻找OSCC治疗新靶点提供了实验依据。 第二部分SNARE蛋白YKT6介导口腔鳞状细胞癌侵袭转移及CD8+T细胞浸润作为预后与免疫治疗潜在生物标志物的研究 在第一部分的研究中，我们解析了OSCC发生与恶性增殖的分子机制，其可能是患者预后不良的原因之一。此外，OSCC具有高度侵袭性，通常会发生颈部淋巴结转移，同时，OSCC免疫细胞浸润水平以及免疫原性往往较差，免疫治疗应答率低，导致患者预后不良。因此，我们迫切需要探究OSCC侵袭转移的分子机制以及挖掘潜在免疫治疗应答和预后生物标志物。基于临床样本的多组学分析能够反映肿瘤异质性，对于鉴定免疫治疗应答及预后生物标志物具有重要意义。在本研究中，我们结合HNSCC/OSCC大样本队列数据，通过生物信息学加权基因共表达网络构建以及生存分析方法，挖掘发现SNARE蛋白YKT6对于预测免疫治疗应答和患者预后具有潜在价值。YKT6已被报道参与细胞内囊泡运输、外泌体产生与释放，以及自噬小体与溶酶体融合等过程，但其在肿瘤进展中的功能，特别是在抗肿瘤免疫中的作用仍不清楚。 研究目的 1.探究YKT6在OSCC中的异常表达水平及其临床意义; 2.揭示YKT6在OSCC恶性发展中的作用及分子调控机制; 3.探究YKT6在OSCC中与免疫微环境的相关性。 方法与结果 1.加权基因共表达网络鉴定红色基因模块为0SCC相关核心模块 我们通过CIBERSORT算法结合OSCC患者基因表达数据计算得到CD8+T细胞浸润水平，再利用加权基因共表达网络鉴定出红色模块基因与病理N(pN)分期及CD8+T细胞浸润水平显著相关。GO分析表明，红色模块基因在细胞外基质组成、TGF-β受体信号通路调控以及细胞外信号转导等过程中显著富集。KEGG通路分析表明，这些基因与细胞外基质-受体相互作用和细胞黏附相关。 2.YKT6被鉴定为影响0SCC预后的核心基因 通过数据库中OSCC与癌旁组织基因表达差异分析，得到946个表达上调基因。与红色模块中连接度最高的100个基因取交集，得到29个候选基因。随后利用R语言“survminer”包获得截断值进行K-M生存分析和log-rank检验。最后，通过Ranger随机森林以及滑动窗口法，我们确定了YKT6高表达与不利生存结局相关，并定义YKT6为研究目标基因。 通过单因素与多因素Cox回归分析，我们发现YKT6高表达是患者生存显著危险因素。并且，我们将YKT6表达与肿瘤分期这两种独立生存预测因子整合绘制诺模图模型。受试者工作曲线下面积结果显示，该模型能够出色地预测患者生存情况。 3.YKT6在恶性HNSCC/OSCC中表达上调 在公共数据库中，我们通过单细胞测序数据分析、卡方检验、Fisher精确检验等统计学方法，发现YKT6在肿瘤组织中表达高于正常对照组织，并且YKT6过表达与HNSCC/OSCC进展、复发、免疫功能障碍、肿瘤纯度以及不良预后相关。基因组数据分析结果揭示拷贝数和DNA甲基化水平改变可能是YKT6表达上调的潜在机制。随后，我们利用收集的临床样本进行Westernblotting和免疫组织化学染色实验，结果显示YKT6在OSCC组织中表达高于癌旁组织，随pN分期的升高而上调。 4.YKT6参与OSCC癌症相关信号通路 在OSCC数据集中进行GSVA分析，我们发现EMT、TGF-β信号通路、缺氧、肿瘤信号通路、蛋白质分泌途径、TNF-α信号通路以及NF-κB信号通路在YKT6高表达组中显著富集。而YKT6低表达组患者中T细胞与B细胞受体信号通路增强。 5.YKT6在体外促进OSCC细胞侵袭和迁移 细胞伤口愈合实验结果显示，YKT6敲低抑制OSCC细胞迁移。Transwell实验表明，当YKT6干扰时，细胞侵袭与迁移能力降低。Westernblotting实验显示，随着YKT6表达降低，OSCC细胞中MMP9蛋白表达下降。此外，ELISA实验显示，当YKT6表达下调时，TGF-β1蛋白分泌减少。 6.YKT6高表达指示0SCC中CD8+T细胞浸润水平低 TIMER2数据库分析结果显示，在HNSCC患者中，YKT6高表达与CD8+T细胞浸润程度呈显著负相关。同时，YKT6基因拷贝数改变会影响CD8+T细胞的浸润水平。我们利用CIBERSORT、EPIC、ssGSEA算法计算出OSCC患者肿瘤免疫微环境相关分数，发现YKT6表达与CD8+T细胞浸润水平、免疫相关指标以及CCL5、CCR5、CCR2、CXCR3、CXCL9等趋化因子表达呈负相关。免疫组织化学染色验证OSCC中YKT6与CD8+T细胞浸润水平的负相关性。 7.YKT6可预测免疫检查点阻断剂治疗应答 在OSCC队列中，YKT6与PD-1、CTLA-4、IDO1等免疫检查点表达呈负相关，而肿瘤突变负荷与YKT6关系较弱。通过ssGSEA以及相关性分析，我们发现随着YKT6表达增加，OSCC样本免疫细胞溶解活性、肿瘤浸润淋巴细胞比例、免疫检查点水平、人类白细胞抗原丰度、免疫调节水平、抗原呈递细胞共刺激和T细胞共刺激水平下降。进一步通过TIDE、IPS、Submap算法，计算分析发现YKT6低表达组OSCC患者可能比YKT6高表达组对免疫检查点阻断剂治疗更敏感。随后，我们又通过免疫治疗数据集对上述结果加以证实。 8.YKT6在人类泛癌中研究分析 最后，我们利用TCGA样本进行泛癌分析。研究结果表明，YKT6在多种类型肿瘤中呈现高表达，其拷贝数发生扩增。在不同类型的肿瘤中，YKT6表达与免疫评分、激活的CD8+T细胞水平、激活的B细胞水平、效应记忆CD8+T细胞水平、嗜酸性粒细胞水平、免疫细胞溶解活性等负相关，而与高肿瘤纯度、细胞外基质-受体相互作用、TGF-β信号通路以及EMT-2水平呈正相关。单因素Cox回归分析验证YKT6表达对患者的预后价值。 结论和意义 在本研究中，我们通过多组学数据分析结合生物学实验验证，发现SNARE蛋白YKT6在OSCC中表达上调，且其高表达与OSCC患者生存期较短相关。同时，YKT6促进OSCC细胞侵袭与迁移，并参与肿瘤免疫微环境的重塑过程，由此表明YKT6可能成为OSCC预后判断、免疫治疗反应、以及治疗靶标的潜在生物标志物。以上研究有助于阐明OSCC恶性转化的新机制，为制定有效的OSCC生物标志物及发现新靶点提供实验依据。
NETL