摘要
目的 本研究基于制剂过程寻找经典名方桃红四物汤的关键质量控制指标，采用筛选得到的关键质控指标优化其煎煮工艺；同时通过代谢组学和肠道菌群研究其治疗血虚血瘀的药效作用和机理，为其经典名方制剂的研究开发与临床应用奠定基础。 方法 第一部分：按照经典名方制备过程的关键步骤，制备桃红四物汤一次煎煮（A组）、二次煎煮（B组）、冷冻干燥（C组）3个制备过程样品，建立18批药材3组样品的HPLC指纹图谱，采用中药指纹图谱相似度评价系统进行数据处理，SPSS20.0软件进行系统聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA），SIMCA14.1软件进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），分析3组样品中化学指纹信息的动态变化，找出变化大的成分，作为关键质量控制指标。 第二部分：基于第一部分分析得到的桃红四物汤关键质控指标结合成分可测性，将地黄苷D、阿魏酸、芍药苷、羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、藁本内酯6种成分作为工艺评价指标。基于质量概貌和关键质控成分含量测定综合评价，采用Box-Behnken设计-响应面设计，预测桃红四物汤最优水提工艺。 第三部分：采用冰水浴联合环磷酰胺制备中医血虚血瘀证模型，将大鼠随机分为空白组、血虚血瘀模型组、阳性组、桃红四物汤治疗组（5g/kg、10g/kg、20g/kg），对大鼠体征变化进行观察，大鼠体重变化率、血常规、凝血功能等相关指标进行检测，初步探讨桃红四物汤治疗血虚血瘀证的药效作用。 第四部分：采用UPLC-Q-Exactive技术结合质谱信息分析平台，对大鼠血浆中代谢物进行鉴定，使用PLS-DA等多元统计分析选各组间的差异代谢物并分析其代谢通路，揭示血虚血瘀模型的致病机制以及桃红四物汤的治疗机制。 第五部分：使用16SrDNA测序技术鉴定肠道菌群，通过PCoA、NMDS等统计分析寻找组间物种多样性差异，研究桃红四物汤干预后大鼠肠道菌群结构与组成的变化，并鉴定丰度显著差异的菌属，从肠道菌群角度分析桃红四物汤对血虚血瘀证可能存在的作用机制。最后，综合药效指标、代谢组学和肠道菌群数据综合揭示桃红四物汤治疗血虚血瘀证的潜在作用机制。 结果 第一部分：建立了一煎样品（A组）、二煎样品（B组）、冷冻干燥样品（C组）3个组别样品指纹图谱，选取18批样品的17个色谱峰作为共有峰，其相似度分别大于0.900；共指认出没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、苦杏仁苷、咖啡酸、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯共10个成分。HCA、PLS-DA将54批样品分为2类，A组样品一类，B、C组样品一类；PLS-DA分析筛选出6个差异性色谱峰；根据PCA综合模型计算，综合评分结果为B组＞C组＞A组，辨识得到藁本内酯、没食子酸、阿魏酸、苦杏仁苷、洋川芎内酯A等是影响样品质量的标志性差异物质。 第二部分：通过指纹图谱综合评价和6个指标成分综合评分筛选得到的最佳工艺的基础上，采用Box-Behnken设计-响应面法对桃红四物汤煎煮工艺进行进一步优化，并结合实验室的可操作性，选择最佳工艺条件为，加10倍量水，浸泡0.5h，煎煮2次，每次1h。 第三部分：桃红四物汤给药组可显著改善血虚血瘀模型导致的体征变化、体重增长率低、脾脏损坏等现象；同时可改善造模导致的PLT、WBC降低，显著升高造模大鼠血清中的GM-CSF、M-CSF、IL-3含量；桃红四物汤各剂量组显著改善造模导致的血液和血浆粘度变化，改善凝血功能。 第四部分：代谢组学分析确定了桃红四物汤对29个潜在差异代谢物具有干预作用，其中包括β-丙氨酸、牛磺酸、L-酪氨酸显著降低，L-精氨酸等代表性差异代谢物的显著升高，桃红四物汤给药干预后可显著改善这些代谢物的变化。桃红四物汤对8条代谢通路有调节作用。 第五部分：肠道菌群数据显示，血虚血瘀模型组Firmicutes、Bacteroidota相对丰度显著降低，Firmicutes/Bacteroidetes值也显著降低，Actinobacteria、Spirochaetota、Proteobacteria、Campilobacterota等致病菌的相对丰度显著升高。桃红四物汤干预后，有益菌丰度升高，致病菌丰度降低。肠道菌群与差异代谢物相关性分析表明，两者密切相关，桃红四物汤通过这两个因素相互调节影响宿主血液系统，改善大鼠血虚血瘀证。 结论 本文在科学辨识制剂过程质量控制指标的基础上，优化桃红四物汤煎煮工艺，并从代谢组学和肠道菌群角度揭示桃红四物汤治疗血虚血瘀证的药效作用机理，为古代经典名方桃红四物汤制剂开发和临床应用奠定基础。
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