摘要
目的： 通过体内和体外抗肿瘤实验方法，从“提取物-组分-成分”层次探讨西洋参皂苷抗肺癌作用及其相关分子机制。 方法： 1西洋参抗肺癌有效物质筛选：（1）西洋参含药血清体外抗肺癌活性研究：大鼠灌胃0.156g生药/g的西洋参水煎液，连续给药7天，制备含药血清，以10%、7.5%、5%含药血清作用于肺癌细胞A549，分别作用24h和48h，采用MTT法测定细胞增殖活力。（2）西洋参总皂苷抗肺癌活性研究：制备西洋参总皂苷，并按《中华人民共和国药典》2020年版关于“西洋参”的质量标准要求测定其中人参皂苷Rg1、Re含量；进一步，对体外培养的肺癌A549细胞和H1975细胞，给予西洋参总皂苷0.7mg/ml~1.6mg/ml，作用24h，采用MTT法测定细胞活力计算IC50，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 2西洋参中人参皂苷抗肺癌有效成分筛选：通过文献整理，选择西洋参中含有的13种人参皂苷（Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rd2、Rh2、人参二醇、人参三醇），分别作用于五种肺癌细胞LLC、NCI-H1975、SK-MES-1、NCI-H128、A549，采用MTT法测定不同成分对不同细胞增殖活力的影响，寻找作用效果相对突出的成分和敏感细胞株。 3西洋参皂苷成分（人参皂苷Rh2）抗肺癌机制研究：（1）人参皂苷Rh2体外抗肺癌试验：测定人参皂苷Rh2对A549的IC50；显微镜观察细胞形态的变化；检测细胞凋亡、周期和ROS含量的变化；通过自噬双标腺病毒（HBAD-mRFP-GFP-LC3）感染A549肺癌细胞，采用激光共聚焦显微镜观察自噬情况；采用蛋白印迹法检测细胞内Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved-Caspase3、Caspase9、P62、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR蛋白表达情况。（2）人参皂苷Rh2体内抗肺癌试验：采用肺癌细胞Luc-A549接种于裸鼠右下腋，建立异位接种的肺癌荷瘤小鼠模型。分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组（顺铂5mg/kg）、西洋参水煎液组（1g/kg）、西洋参皂苷组（0.3g/kg）、人参皂苷Rh2高、中、低组（100、50、25mg/kg），连续给药18天。测定给药前和给药后每2天的体重和瘤体体积，于末次给药前48h通过活体动物成像系统测定肿瘤内细胞状况，采用超高分辨超声成像系统检测瘤体内的血管密度；末次给药后，将小鼠置于22±2℃水中进行无负重游泳力竭试验记录时间；游泳20min后，剥取瘤体、心、肝、脾、肺、肾脏，称重计算抑瘤率和脏器系数；测定血清中乳酸、尿素氮，肝糖原水平；对瘤体进行HE和Tunnel染色观察病理和细胞凋亡情况；免疫荧光法观察瘤体内血管情况；采用蛋白印迹法检测瘤体内Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved-Caspase3、Caspase9、P62、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR蛋白表达情况。 结果: 1.西洋参皂苷抗肺癌有效物质筛选试验结果 （1）不同比例的西洋参含药血清作用A549细胞24h时，10%含药血清抑制率最高为28.98%；作用48h时，抑制率随含药血清含量增加而降低，含药血清含量为5%时抑制率最高，为19.74%。 （2）作用24h时，西洋参总皂苷对体外培养A549细胞、H1975细胞的IC50分别为0.90mg/ml、1.29mg/ml。故选择A549细胞进行后续实验，在0.25、0.5、1mg/mL的西洋参总皂苷浓度作用下，可诱导A549细胞的凋亡率分别为17.85%、20.70%、29.43%，与空白组相比具有显著性差异（P＜0.01）。 2.西洋参中人参皂苷抗肺癌细胞株活性筛选试验结果 当作用24h或48h时，受试的人参皂苷类成分对各肺癌细胞的活性有不同程度的增殖抑制，其中人参皂苷Rh2对四种肺癌细胞均有较好的抑制作用，对H1975、NCI-H128、A549、LLC的IC50分别为26.05、70.75、16.08、7.92μg/ml和23.12、4.36、13.97、47.91μg/ml。 3.人参皂苷Rh2抗肺癌机制研究试验结果 （1）人参皂苷Rh2体外抗肺癌机制研究试验结果：人参皂苷Rh2对A549细胞增殖抑制作用呈现明显的浓度-时间依赖性，在作用时间点为24、48、72h时，IC50分别为8.58、7.12、5.45μg/ml，细胞形态出现明显变化。随着给药时间延长，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），荧光显微镜直观反映人参皂苷Rh2作用后使A549细胞发生细胞凋亡数量和坏死数量明显增加。人参皂苷Rh2在12h和24h将细胞分别阻滞在G0/G1和S期，但无显著性差异，细胞内自噬体和ROS含量增加。蛋白印迹实验结果表明，人参皂苷Rh2作用A549细胞后，细胞中促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9、cleaved-caspase3表达增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低；使自噬相关蛋白P62表达降低而LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加，并显著抑制通路蛋白PI3K/Akt/mTOR的表达（P＜0.01或0.05）。 （2）人参皂苷Rh2体内抗肺癌机制研究试验结果：与空白对照组比较，给药后阳性对照组小鼠体重显著降低（P＜0.01），西洋参提取物各给药组小鼠体重无明显异常。与空白对照组比较，模型组小鼠的肝与肺指数显著降低，脾脏指数显著升高（P＜0.01或P＜0.05），而人参皂苷Rh2各给药组能不同程度地升高裸小鼠的肝、肺指数，降低脾脏指数（P＜0.01或P＜0.05）。与模型对照组比较，Rh2各组瘤体体积、瘤重显著降低，100mg/kg组抑瘤率最高为69.98%，瘤体内细胞的荧光强度、血管密度显著降低，肿瘤坏死出血区域、肿瘤组织大小、疏松区占比降低，凋亡细胞数量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。与空白对照组比较，模型对照组游泳时间显著降低，血清中乳酸、尿素氮的含量均显著升高、肝糖原的含量显著性降低（P＜0.05或P＜0.01），与模型对照组比较，西洋参皂苷及人参皂苷Rh2各组游泳时间升高，乳酸、尿素氮水平显著降低，肝糖原水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rh2可以使肺癌瘤体内Bax、Caspase3、Caspase9、cleaved-caspase3、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达增加，Bcl-2、P62表达降低，并显著抑制通路蛋白PI3K/Akt/mTOR的表达（P＜0.01或0.05）。 结论： 1.西洋参具有抗肺癌作用，西洋参总皂苷是重要的有效部位，可诱导肺癌细胞凋亡，所含人参皂苷成分能不同程度抑制多种肺癌细胞活性，其中以人参皂苷Rh2对肺癌细胞A549作用最明显。 2.人参皂苷Rh2具有体内体外抗肺癌作用，可诱导肺癌细胞凋亡、自噬，机制与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。此外，人参皂苷Rh2较之顺铂可更好地改善小鼠整体状态，其抗肺癌机制还可能与抑制瘤体血管生长有关。
NETL