摘要
脑出血是一种严重的急性脑血管事件，对应于中医的出血性中风，其高死亡率和致残率给国家和社会造成巨大的经济损失和医疗负担。脑出血后多种继发性级联反应共同作用使神经细胞进入死亡程序，恶化神经功能。目前临床上尚缺乏特效药物抑制这些级联损害的发生和发展，而中医药对于卒中继发性损害的治疗有其独特优势，并逐渐得到关注，且治疗的分子机制也在被广泛的探索和研究。 陈绍宏教授在对中风中医病机级联损害认识的基础上研发了中风醒脑复方，并获国家专利。前期临床研究显示中风醒脑复方的液剂型（中风醒脑液）可改善卒中患者的神经功能及预后，实验研究也发现其具有抑制卒中继发性损害的作用。现为进一步研究其对脑出血的治疗作用，本次临床试验采用多中心、双盲、随机对照的研究方法以评价中风醒脑复方的颗粒剂型（中风醒脑颗粒）治疗脑出血的临床疗效和安全性。此外，通过网络药理学方法对其有效成分可能作用的靶点分子和潜在信号通路进行预测，并以此为切入点开展动物实验以探讨中风醒脑颗粒治疗脑出血的分子机制。 目的： 1.采用多中心、双盲、随机对照的临床研究方法评价中风醒脑颗粒治疗脑出血的临床疗效和安全性。 2.通过网络药理技术对中风醒脑颗粒治疗脑出血可能作用的靶点分子和潜在信号通路进行预测。 3.以网络药理结果为切入点，通过动物实验探讨中风醒脑颗粒治疗脑出血的分子机制。 方法： 1.采用多中心、双盲、随机对照的临床研究方法，研究对象为成都中医药大学附属医院急诊科、西南医科大学附属医院急诊科、川北医学院附属医院急诊科、四川省中西医结合医院急诊科住院并符合纳排标准的70例急性脑出血患者。观察组治疗方式为西医常规治疗联合中风醒脑颗粒口服，对照组则西医常规治疗加用安慰剂，在治疗的7d、14d、21d对脑出血患者的血肿吸收量、神经功能缺损评分、日常生活能力评分、中医证候积分和积分疗效以及安全性进行评估。 2.通过TCMSP数据库和Uniprot数据库筛选中风醒脑复方化合物作用的靶基因，以“Cerebralhemorrhage”、“Intracerebralhemorrhage”、“Brainhemorrhage”为检索词在OMIM、Drugbank、GeneCards、DisGeNET基因数据库筛选出脑出血相关的人类靶基因，利用VENNY2.1.0网络工具将中风醒脑复方化合物作用的靶基因与脑出血筛选的相关靶基因进行交集，然后通过String数据平台搭建中风醒脑复方作用于脑出血的蛋白PPI网络图，再利用Cytoscape软件对数据进行拓扑分析，筛选中风醒脑复方治疗脑出血的关键靶基因。通过DAVIDBioinformaticsResources6.8数据平台对中风醒脑复方治疗脑出血的预测基因进行信号通路富集分析（KEGG富集分析），以P值小于0.05为条件筛选显著富集通路，并综合分析中风醒脑复方治疗脑出血可能作用的靶基因和潜在信号通路。根据中风醒脑复方制剂的前期基础研究结果和临床研究结果，选取相应的信号通路进行实验验证。 3.对实验大鼠随机分组后采用Ⅳ型胶原酶和生理盐水构建大鼠脑出血模型和假手术模型，再将建立成功的脑出血大鼠随机分为中风醒脑颗粒治疗组和模型组，使用动物与人体每日等效剂量的中风醒脑颗粒给予大鼠灌胃7d，每次剂量为1.24g/kg，每日2次。其余两组均给予生理盐水同步灌胃。通过神经功能缺损评分观察各组大鼠在给药的1d、3d、7d神经功能恢复情况以及通过Image-ProPlus6.0软件检测各组大鼠三个时间点的血肿体积，评价中风醒脑颗粒对脑出血大鼠血肿吸收情况的影响。此外，通过免疫组化法检测目的基因TLR4表达位置和强弱，酶联免疫吸附测定法检测脑出血大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量、血清IL-8水平以及蛋白质印记技术检测血肿区MyD88、NF-κB、IκBα、CD36蛋白表达水平。 结果： 1.临床研究结果：（1）与单纯西医常规治疗比较，中风醒脑颗粒联合西医常规治疗在7d、14d、21d均可明显降低脑出血患者神经功能缺损评分，改善神经预后，组间比较有差异（F＝7.829，P＝0.007）。（2）与单纯西医常规治疗比较，在治疗的21d中风醒脑颗粒联合西医常规治疗有助于提高脑出血患者日常生活能力评分，组间比较有差异（F＝5.428，P＝0.023）。（3）与单纯西医常规治疗比较，在治疗的21d中风醒脑颗粒联合西医常规治疗有助于降低脑出血患者中医证候积分，组间比较有差异（F＝4.441，P＝0.039），以及提高中医证候积分疗效，组间比较有差异（Z＝2.071，P＝0.038）。（4）与单纯西医常规治疗比较，在治疗的14d和21d中风醒脑颗粒联合西医常规治疗均可明显加快脑出血患者血肿的清除，组间比较有差异（F＝4.485，P＝0.038）。（5）与单纯西医常规治疗比较，中风醒脑颗粒联合西医常规治疗未增加药物相关不良反应的风险（P＞0.05）。 2.网络药理学结果：通过TCMSP数据库和Uniprot数据库最终获得中风醒脑复方化合物作用的人源靶基因（Symbol）536个，通过OMIM、Drugbank、GeneCards、DisGeNET基因数据库筛选出脑出血相关的人类靶基因1645个，利用VENNY工具获得交集基因91个。再利用Cytoscape软件筛选出中风醒脑复方治疗脑出血的关键靶基因25个，包括TLR4、RELA、TNF、IL6、IL1B、CXCL8、IL10、JUN、MAPK1,MMMP9,ICAM1等。通过DAVID数据平台分析出与脑出血相关的显著富集信号通路20条，包括Toll样受体（TLR）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、核因子-kappaB（NF-kappaB）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等，结合前期临床前和临床研究所发现的中风醒脑复方制剂的抗炎结果，再查阅脑出血相关文献，最终选取TLR4/NF-κB信号通路作为治疗靶点，并开展动物实验进行验证。 3.实验研究结果：（1）与模型组比较，中风醒脑颗粒组大鼠神经功能缺损评分显著降低，血肿吸收明显增加（P＜0.05）。（2）中风醒脑颗粒组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6的含量明显低于模型组（P＜0.05）。（3）中风醒脑颗粒组大鼠血肿区TLR4的表达明显低于模型组（P＜0.05）。（4）与模型组比较，中风醒脑颗粒组TLR4下游信号分子NF-κB蛋白的表达明显降低（P＜0.05），IκBα蛋白表达则显著增加（P＜0.05）。（5）与模型组比较，中风醒脑颗粒组CD36受体蛋白的表达在给药3d后显著增加（P＜0.05）。 结论： 1.与单纯西医常规治疗相比，中风醒脑颗粒联合西医常规治疗明显降低脑出血患者神经功能缺损评分，提示中风醒脑颗粒联合西医常规治疗改善脑出血患者神经预后的临床疗效优于单纯西医常规治疗。 2.与单纯西医常规治疗相比，中风醒脑颗粒联合西医常规治疗显著升高脑出血患者日常生活能力评分，提示中风醒脑颗粒有助于改善脑出血患者日常生活能力。 3.与单纯西医常规治疗相比，中风醒脑颗粒联合西医常规治疗明显降低脑出血患者中医证候积分以及提高中医证候积分疗效，提示中风醒脑颗粒有助于改善脑出血患者中医临床表现。 4.与单纯西医常规治疗相比，中风醒脑颗粒联合西医常规治疗可显著加快血肿的清除，提示中风醒脑颗粒联合西医常规治疗在促进血肿吸收方面优于单纯西医常规治疗。 5.与单纯西医常规治疗相比，中风醒脑颗粒联合西医常规治疗未增加药物相关不良反应风险，提示中风醒脑颗粒治疗脑出血是安全的。 6.中风醒脑颗粒可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路抑制脑出血神经炎症反应以及增加清道夫受体CD36蛋白的表达，加速血肿的清除，减少促炎因子、神经毒性分子的释放，保护神经。
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