摘要
第一部分：中风醒脑颗粒对脑出血患者神经功能保护的临床研究 背景：脑出血（Intracerebralhemorrhage，ICH）的死亡率和残障率仍然居高不下，严重影响患者生活质量，如何有效的减轻患者出血后神经损伤，提高脑出血患者的存活率、降低致残率，已成为近代神经医学工作者的研究重点和方向。脑出血的治疗主要包括外科手术与内科保守治疗，但尚无突破性进展，仍没有有效的处理方法，因此对脑出血的治疗仍需深入研究、不断探索。目前，国内外医学界认为中西医结合方式是治疗脑出血可采取的有效模式，是出血性脑卒中现代治疗趋向。中风醒脑液是我院陈绍宏教授团队根据多年临床经验研制，广泛运用于临床脑梗死、脑出血的治疗，其疗效确切。但因其临床研究无盲法，设计不够严谨，结果存在偏倚，导致推广受限。因此，进一步深入研究中风醒脑颗粒对脑出血的临床疗效，提供科学的依据，对其临床推广具有重要意义。 目的：通过改变药物剂型，设计开展严谨的多中心、随机、对照、双盲的研究方法，评价中风醒脑颗粒对患者脑出血后神经功能的有效性及安全性。 方法：运用SPSS软件产生随机数的方法，将纳入的受试者按1∶1比例分为观察组和对照组，观察组予以基础治疗联合中风醒脑颗粒，对照组予以基础治疗联合安慰剂。观察两组患者治疗28天后死亡率及治疗前后NIHSS评分、GCS评分等，并对生存者进行90天随访，评价中风醒脑颗粒对脑出血的疗效性及安全性。 结果：自2019年2月1日截止到2020年11月30日，四个研究中心总共纳入98例受试者：①死亡率：两组患者治疗28天后死亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）； ②NIHSS评分：组间比较：治疗后第7天，两组患者比较，差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后第14天、28天两组间比较，统计有显著性差异（P＜0.05）；组内比较：观察组和对照组在治疗第7天、14天、28天各时间点的NIHSS评分均较治疗前有统计学差异，且同一时间点中风醒脑颗粒组NIHSS评分下降差值更大（P＜0.05）； ③GCS评分：组间比较：治疗第7天，两组比较，结果无统计学差异（P＞0.05），在治疗第14天、28天两组间比较，有显著性差异（P＜0.05）；组内比较：观察组和对照组在治疗第7天、14天、28天各时间点GCS评分比较均较治疗前有统计学差异，且同一时间点中风醒脑颗粒组GCS评分增高差值更大（P＜0.05）； ④不良预后发生率：28天后不良预后发生率两组间比较，无统计学差异（P＞0.05）； ⑤不良反应：观察组出现4例轻度不良反应，对照组出现6例轻度不良反应，均自行缓解，两组间比较无统计学差异（P＞0.05）。 ⑥随访：随访90天后，远期生存结局两组比较无统计学差异；但NIHSS评分、mRS评分两组比较有统计学差异（P＜0.05）。 结论：中风醒脑颗粒能改善脑出血患者的神经功能缺损、意识状态、神经功能预后，且随时间发展，其作用仍然存在。 第二部分：基于网络药理探讨中风醒脑颗粒对脑出血的作用机制 目的：利用网络药理学技术以及Cytoscape可视化软件分析，检索中风醒脑颗粒治疗脑出血（Intracerebralhemorrhage，ICH）的有效成分及可能的作用靶点，预测中风醒脑颗粒治疗ICH的作用机制。 方法：检索TCMSP数据平台，分别检索中风醒脑颗粒的四味中药人参、大黄、川芎、三七的活性成分、作用靶点；GeneCards数据库、OMIM数据库和DisGenet数据库检测ICH的靶点；将得到的中风醒脑颗粒、ICH疾病的共同靶点筛选出来，构建“成分-靶点-疾病”互作网络，并通过Metascape数据库对靶点网络进行GO分析和KEGG富集分析，最后采用Cytoscape软件对分析结果做可视化网络图。 结果：①经筛选得到中风醒脑颗粒有效成分43个和193个潜在作用靶点；②通过合并数据库检索信息，得到出血性卒中1003个相关靶点信息，与中风醒脑颗粒四位中药的潜在靶点合并得到66共同靶点；③度值前五的化合物分别为槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素、杨梅酮、β-谷甾醇，为中风醒脑颗粒网络中的关键成分；④前五的关键靶点：VEGFA、AKT1、TP53、MAPK1、MMP9；⑤GO分析、KEEG分析：中风醒脑颗粒涉及调节损伤反应、细胞增值迁移调控、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡信号通路、聚合酶11调控pri-miRNA转录、炎症反应等。⑥分子对接：靶点AIF、BAX、BCL-2、Caspase-3、Caspase-9与关键成分槲皮素、山奈酚、芦荟大黄素、杨梅酮、β-谷甾醇有一定的结合。 结论：中风醒脑颗粒可能通过调节半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡信号通路、损伤反应、聚合酶11调控pri-miRNA转录、炎症反应等信号通路，多靶点治疗脑出血。 第三部分：中风醒脑颗粒对大鼠脑出血继发性损伤的保护作用及机制研究 背景：脑出血后造成的损伤主要包括原发性和继发性损伤：脑出血后血肿占位压迫效应影响正常脑组织血流灌注，造成原发性损伤；血液相关成分及其代谢产物、毒性物质引起脑缺血、细胞水肿、氧化应激、炎症反应等引发的继发性损伤，神经细胞因此受损并出现功能障碍、细胞变性死亡等，可导致病情进一步加重，严重影响患者预后。细胞凋亡在ICH后神经元死亡中发挥重要作用，这一关系使抗凋亡药物成为抑制ICH后细胞凋亡，改善预后的可能治疗靶点之一，通过网络药理进行初步探测，发现中风醒脑颗粒复方成分能够通过干预细胞凋亡方式参与脑出血的治疗。 目的：通过建立胶原酶诱导脑出血大鼠模型，以中风醒脑颗粒干预，观察大鼠脑组织凋亡细胞数、及相关蛋白（Bax、Bcl2、caspase3、AIF、细胞色素C）等的表达，探讨中风醒脑颗粒对脑出血后细胞凋亡的作用。 方法：选取雄性健康SD大鼠54只，根据造模方式分为两组：假手术组(Sham组)18只、模型组36只，模型组造模成功后按随机法分为两组：模型组（Mod组）18只、中风醒脑颗粒组(ZF组)18只，再将三组根据干预时间24小时、3天、7天分为三个亚组，每组各6只。造模：在三维立体脑定位下注入Ⅳ型胶原酶1ul制备实验性脑出血大鼠模型，Sham组以相同方式注入同等剂量生理盐水。造模后运用LongaFZ评分法评估实验大鼠的神经缺损情况，及判断造模成功与否。给药：ZF组选择灌胃给药途径（中风醒脑颗粒2.48g/kg.d），Sham组及Mod组灌胃同等剂量的生理盐水，灌胃时间及方式同ZF干预组。检测方法：按干预时间（24h，3d，7d）分批处死各组6只大鼠，取出脑组织进行指标检测。采用TUNEL染色方式检测各时间点（24h，3d，7d）各组大鼠脑组织的细胞凋亡数目和形态；通过Westernblot法检测不同组大鼠脑内脑组织凋亡相关蛋白Cyt-c、Caspase-3、Bcl-2、Bax及AIF诱导因子的表达水平。 结果：（1）细胞凋亡数目：本实验脑组织细胞凋亡水平检测结果显示：与Sham组比较，Mod组（24h、3d、7d）凋亡阳性细胞明显增多，有显著性差异（P＜0.05）；与Mod组比较，ZF组（24h、3d、7d）凋亡细胞数均低于Mod组，有显著性差异（P＜0.05）。 （2）细胞凋亡蛋白水平：①Bcl-2：与Sham组相比，Mod组、ZF组脑组织的Bcl-2蛋白表达水平于第3d、7d低于Sham组，有统计学差异（P＜0.05），ZF组24hBcl-2蛋白表达高于Sham组，有统计学差异（P＜0.05）；与Mod组相比，ZF组组织中Bcl-2蛋白阳性细胞于24h、3d表达升高，两组间有显著差异（P＜0.05）。 ②Bax：与Sham组相比，Mod组脑组织的Bax蛋白表达水平于第24h、3d、7d均高于Sham组（P＜0.05），有显著差异；与Mod组相比，ZF组组织中Bax蛋白于24h、3d、7d降低，两组间有显著差异（P＜0.05）。 ③Bcl-2/Bax比值：ZF组24h、3d、7d二者的比值均高于Mod组，两组间有显著差异（P＜0.05）； ④Caspase-3：ZF组脑组织的Caspase-3蛋白表达水平于第24h、3d均低于Sham组相比，有统计学差异（P＜0.05）；与Mod组相比，ZF组组织中Caspase-3蛋白表达于第24h、7d降低，两组间有显著差异（P＜0.05） ⑤Cyt-c：与Sham组相比，ZF组脑组织的Cyt-c表达水平于第24h、3d明显高于Sham组（P＜0.05），有显著差异；与Mod组相比，ZF组组织中Cyt-c表达于第7d低于Mod组，但两组间无显著差异（P＜0.05）； ⑥AIF：与Sham组相比，ZF组脑组织的AIF蛋白表达水平于第24h、3d明显低于Sham组，有统计学差异（P＜0.05）；②与Mod组相比，ZF组组织中AIF蛋白表达于第24h、7d均低于Mod组，两组间有统计学差异（P＜0.05）。 结论：中风醒脑颗粒能够改善实验性脑出血大鼠神经功能评分，其作用可能是通过减少脑细胞凋亡数目，参与调控凋亡相关蛋白，抑制细胞凋亡途径。
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