摘要
研究目的 评价针刺治疗慢性疲劳综合征（Chronicfatiguesyndrome，CFS）下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal，HPA）轴的临床效应，并初步探讨针刺调控CFSHPA轴miR-3074-5p/cAMP-PKA/TORC2/p-CREB信号通路机制。 研究方法 1.队列研究：严格按照纳排标准，纳入30例健康受试者和30例CFS患者。运用Chalder疲劳量表评估受试者的疲劳程度，采用ELISA法检测受试者血浆CRH、血浆ACTH和血清DHEA的激素水平。以健康受试者为对照组（A组），CFS患者为观察组（B组），评估CFS患者疲劳情况和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴激素的分泌水平，明确CFS患者存在的疲劳情况和HPA轴激素分泌功能失调。 2.随机对照试验：将30例CFS患者按照分层随机方法分为针刺组（C组）和安慰针刺组（D组）。C组选取百会、肝俞、肾俞、脾俞、足三里予针刺治疗，D组选取位于四肢的5个非经非穴，双侧部位交替针刺。C组得气后行平补平泻手法，D组不得气不行针，于每天下午北京时间17:00-19:00进行治疗，两组每次均留针30分钟，连续针刺6周，共20次。治疗结束后以Chalder疲劳量表评估两组患者疲劳程度，并采用ELISA技术检测两组CFS患者血浆CRH、ACTH和血清DHEA的激素水平，探讨针刺对CFS患者的疲劳情况和HPA轴激素分泌功能的调节作用。 3.动物实验：将30只SD雄性大鼠编号、称重，依体重分层后，按随机数表法随机分为空白对照组（A组）、模型组（B组）、针刺组（C组）、miRNA拮抗剂组（D组）、模型+生理盐水组（E组），每组6只，B组、C组、D组、E组通过慢性束缚+力竭游泳实验建立CFS模型，通过观察大鼠的一般状态、力竭游泳实验、高价十字迷宫和开场实验进行行为学检测，以评估是否成功造模CFS大鼠。造模成功后，D组大鼠每周针刺前注射miR-3074-5pantaganir拮抗剂，E组大鼠每周针刺前注射等量的生理盐水。治疗期间，A组、B组予捆绑固定，C组、D组、E组予捆绑固定后予针刺穴位“百会”、“肝俞”、“脾俞”、“肾俞”、“后三里”，于每天下午北京时间17:00-19:00行针刺干预，每日针刺1次，每次留针15分钟，连续治疗3周，即治疗21次后进行麻醉采血、取下丘脑组织。采用ELISA检测血浆CRH、ACTH和血清DHEA的含量，q-PCR检测外周循环血miR-3074-5p的含量，WB法检测下丘脑组织中cAMP、P-PKA、TORC2、P-CREB蛋白的表达水平，分析针刺对CFS大鼠HPA轴miR-3074-5p/cAMP-PKA/TORC2/p-CREB信号通路的影响，并反向验证针刺调控CFS大鼠HPA轴miR-3074-5p/cAMP-PKA/TORC2/p-CREB信号通路的机制。 研究结果 1.队列研究：①健康受试者（A组）和CFS患者（B组），两组人口学特征构成均衡。②与A组相比，B组Chalder量表躯体疲劳评分、心理疲劳评分和总分均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示CFS患者存在躯体疲劳和心理疲劳。③与A组相比，B组血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示CFS患者存在HPA轴功能减退。 2.随机对照研究：①治疗前，针刺组（C组）和安慰针刺组（D组）两组人口学特征构成均衡。两组Chalder量表躯体疲劳评分和总分有差异（P＜0.05），C组重于D组，心理疲劳评分差异无统计学意义（P＞0.05）。两组血CRH、ACTH、DHEA水平差异无统计学意义（P＞0.05），两组均衡性良好，具有可比性。②治疗后，两组Chalder量表躯体疲劳评分、心理疲劳评分和总分均显著下降，差异具有统计学意义（均P＜0.01），提示针刺治疗可以缓解CFS患者躯体疲劳和心理疲劳，且针刺效应优于安慰针刺效应。两组治疗前后的组内比较：与治疗前相比，两组治疗后的Chalder量表三项评分均显著下降，差异具有统计学意义（均P＜0.01），提示针刺与安慰针刺均能改善CFS患者躯体疲劳和心理疲劳。③治疗后，两组血CRH、ACTH、DHEA水平均有升高，其中C组显著，差异具有统计学意义（均P＜0.05），提示针刺治疗能够提高CFS患者血CRH、ACTH、DHEA水平，促进HPA轴激素分泌，且针刺效应明显由于安慰针刺效应。两组治疗前后的组内比较：与治疗前相比，C组和D组血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA激素水平升高，C组差异有统计学意义（均P＜0.05），D组仅血浆CRH水平升高的差异有统计学意义（P＜0.05），提示针刺治疗能有效地提高机体血CRH、ACTH、DHEA含量，促进HPA轴功能的恢复。 3.动物实验：①实验前，空白对照组（A组）、模型组（B组）、模型+针刺组（C组）、模型+miR拮抗剂+针刺组（D组）、模型+生理盐水+针刺组（E组）大鼠动作如常，神态安静，披毛分布均匀，大鼠不会出现群集现象。造模初期（造模后前3天），除了A组，其余4组眼神充满敌意，且对外界刺激具有一定的攻击性。随着造模时间的延长（造模后2周内），A组大鼠的精神状态、行为模式、毛发色泽无明显改变，另4组大鼠表现出毛色枯黄、掉毛明显以及容易“激惹”的状态。造模2周-3周，A组仍无明显改变，精神充沛，眼神灵动，脾性温顺易安抚，食量随着体重、体型增大有所增加，毛发颜色亮白；而其余进行造模的4组大鼠精神状态差，体型消瘦，眼神黯淡乏力感，皮毛颜色枯黄，暗淡无光泽，且粗糙易脱落，喜抱团而居，进食量减少，大便稀溏，对外界刺激的攻击性减退，并有躲闪的行为表现，符合CFS大鼠模型的表现。②造模前，空白对照组（A组）、模型组（B组）、针刺组（C组）、模型+miR拮抗组（D组）、模型+生理盐水组（E组）在体重、力竭游泳时长、高架十字迷宫的进入开臂次数和开臂停留时间、开场实验的跨格次数和中央停留时间差异无统计学意义，基线均衡可比；造模后，与A组相比，B组、C组、D组、E组在体重、力竭游泳时长、高架十字迷宫的进入开臂次数和开臂停留时间、开场实验的跨格次数和中央停留时间均显著下降，差异具有统计学意义（均P＜0.01），提示造模成功。③治疗后，与A组相比，B组外周循环血miR-3074-5p含量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示CFS大鼠外周循环血miR-3074-5p存在异常升高。与B组相比，C组外周循环血miR-3074-5p含量显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.01），且C组与A组外周循环血miR-3074-5p含量差异无统计学意义（P＞0.05），提示针刺可以下调CFS大鼠外周循环血miR-3074-5p含量，恢复至正常大鼠水平；D组与A组相比，经针刺治疗后，D组外周循环血miR-3074-5p含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示拮抗miR-3074-5p的表达后，针刺不能使CFS大鼠异常升高的外周循环血miR-3074-5p含量下调至正常水平。与D组相比，E组外周循环血miR-3074-5p含量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），且E组与A组外周循环血miR-3074-5p含量差异无统计学意义，进一步验证了针刺可以下调异常升高的外周循环血miR-3074-5p含量，并恢复至正常大鼠水平。④治疗后，与A组相比，B组下丘脑cAMP相对表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；B组下丘脑P-PKA相对表达差异无统计学意义（P＞0.05）；B组下丘脑P-CREB、P-TORC2相对表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示CFS大鼠下丘脑cAMP、P-CREB、P-TORC2相对表达异常降低，下丘脑P-PKA相对表达无明显异常。与B组相比，C组下丘脑cAMP相对表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），且C组与A组外周循环血miR-3074-5p含量差异无统计学意义（P＞0.05）；C组下丘脑P-PKA相对表达差异无统计学意义（P＞0.05）；C组下丘脑P-CREB、P-TORC2相对表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），且C组与A组下丘脑P-CREB、P-TORC2相对表达差异无统计学意义（P＞0.05），提示针刺可以上调CFS大鼠下丘脑cAMP、P-CREB、P-TORC2相对表达，恢复至正常大鼠水平。D组与A组相比，经针刺治疗后，D组下丘脑cAMP、P-CREB相对表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；D组下丘脑P-PKA相对表达差异无统计学意义（P＞0.05）；D组下丘脑P-TORC2相对表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），提示抑制miR-3074-5p后，针刺不能使CFS大鼠异常降低的下丘脑cAMP、P-CREB、P-TORC2相对表达上调至正常水平。与D组相比，E组下丘脑cAMP、P-CREB相对表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；E组下丘脑P-PKA相对表达差异无统计学意义（P＞0.05）；E组下丘脑P-TORC2相对表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），且E组与A组下丘脑cAMP、P-CREB、P-TORC2相对表达差异无统计学意义，进一步验证了当外周循环血miR-3074-5p的表达未被抑制时，针刺可以升高CFS大鼠异常降低的下丘脑cAMP、P-CREB、P-TORC2相对表达，并恢复至正常大鼠水平。⑤治疗后，与A组相比，B组血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）提示CFS大鼠血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度异常降低。与B组相比，C组血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），且C组与A组血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度差异无统计学意义（P＞0.05），提示针刺可以上调CFS大鼠血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度，恢复至正常大鼠水平。D组与A组相比，经针刺治疗后，D组血浆CRH、血浆ACTH浓度显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），D组血清DHEA浓度差异无统计学意义（P＞0.05），提示抑制miR-3074-5p后，针刺不能使CFS大鼠异常降低的血浆CRH、血浆ACTH浓度上调至正常水平。与D组相比，E组血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），且E组与A组血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度差异无统计学意义，进一步验证了当外周循环血miR-3074-5p的表达未被抑制时，针刺可以升高CFS大鼠异常降低的血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA浓度，并恢复至正常大鼠水平。 研究结论 1.与健康受试者相比，CFS患者Chalder量表心理疲劳评分、躯体疲劳评分和总分均显著升高，CFS患者血浆CRH、血清DHEA含量均显著降低，表明CFS患者存在躯体疲劳和心理疲劳，且HPA轴激素分泌功能减退。 2.治疗后针刺组与安慰针刺组均能降低CFS患者Chalder量表心理疲劳评分、躯体疲劳积分和总分，以及上调血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA水平。与安慰针刺组比较，针刺百会、肝俞、肾俞、脾腧、足三里显著降低CFS患者Chalder量表心理疲劳评分、躯体疲劳积分和总分，并显著上调血浆CRH、血浆ACTH、血清DHEA水平，表明针刺与安慰针刺均能改善CFS患者躯体疲劳和心理疲劳，提高HPA轴激素分泌功能，且针刺治疗效应优于安慰针刺。 3.与空白对照组相比，全血miR-3074-5pmicroRNA表达显著升高，下丘脑中cAMP蛋白、P-CREB蛋白及P-TORC2蛋白表达均显著下调，CFS大鼠血浆CRH浓度、血浆ACTH浓度、血清DHEA浓度降低；针刺后，全血中miR-3074-5p表达接近正常SD大鼠水平，下丘脑中cAMP蛋白、P-CREB蛋白及P-TORC2蛋白表达均显著上调，CFS大鼠血浆CRH浓度、血浆ACTH浓度、血清DHEA浓度均显著升高；抑制CFS大鼠外周循环血miR-3074-5pmicroRNA表达，经针刺治疗后，CFS大鼠下丘脑中cAMP蛋白、P-CREB蛋白及P-TORC2蛋白表达仍然显示显著下调，血浆CRH浓度、血浆ACTH浓度、血清DHEA浓度也显著降低，；而未被抑制外周循环血miR-3074-5pmicroRNA表达的CFS大鼠，经针刺治疗后，下丘脑中cAMP蛋白、P-CREB蛋白及P-TORC2蛋白表达显著上调，CFS大鼠血浆CRH浓度、血浆ACTH浓度、血清DHEA浓度也显著升高。研究结果表明，针刺通过下调CFS外周循环血miR-3074-5p表达，介导并上调下丘脑cAMP、P-PKA、TORC2、p-CREB水平，升高血浆CRH、血浆ACTH和血清DHEA含量，调控功能减退的HPA轴激素分泌功能，从而发挥针刺对CFS大鼠的治疗效应。综上表明：miR-3074-5p/cAMP/P-PKA/TORC2/p-CREB信号通路是针刺调控CFSHPA轴功能的机制之一。
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