摘要
慢性便秘(ChronicConstipation，CC)是一种常见多发病，严重困扰着人们的生活并给社会医疗带来了沉重的负担。在症状学上，便秘主要表现为排便次数减少、粪便干结、排便费力、排便不尽感或排便障碍等。根据结肠运输时间和肛门直肠盆底功能情况等可将便秘分为三种类型，包括正常传输型便秘(NormalTransitConstipation，NTC)、慢传输型便秘(SlowTransitConstipation，STC)和盆底功能紊乱或排便障碍型便秘(DefecatoryorRectalEvacuationDisorders)。其中，STC主要表现为结肠运输时间延长，进食后结肠高振幅推进性收缩（HighAmplitudePeristalticContraction，HAPC）减少。既往研究表明，STC与肠道神经内分泌系统、结肠平滑肌收缩功能、结肠起搏细胞等病理性改变具有一定相关性。然而，关于STC的病理生理仍需要进一步研究。 肠道微生态治疗作为近些年兴起的一种治疗方案，在各种肠道内外疾病中逐渐凸显出其重要性，而菌群移植(FecalMicrobiotaTransplantation，FMT)作为其中一种重要的手段，在治疗难辨梭状芽孢杆菌感染(ClostridiumdifficileInfection，CDI)方面已得到国际临床治疗指南认可。FMT的目标是重新构建患者的肠道微生态系统(IntestinalMicroenvironment)，最终使肠道内原先紊乱的菌群重新达到一个平衡。本课题组的前期工作发现，应用FMT治疗STC，患者的便秘症状得到显著改善。鉴于此，我们认为通过重新构建患者肠道菌群的方法可有效地治疗STC。另一方面，相关研究通过16SrRNA菌群分析发现慢性便秘患者的肠道菌群结构等具有一定特征性改变。前期本课题组通过宏基因组学分析方法，发现与正常对照组相比，STC患者肠道内存在功能菌群和相关菌群所对应功能通路上的差异。在此基础上，我们猜测STC患者的肠道菌群可能是该疾病的致病因素之一。 在本研究课题中，我们首先通过联合抗生素处理的方法构建伪无菌鼠模型，观察并检测伪无菌鼠的粪便性状和肠道动力前后改变情况，以此论证正常肠道菌群的重要性。其次，根据纳入和排除标准初步筛选慢传输型便秘患者，取其新鲜粪便制备成菌液待用，并运用菌群移植方案治疗纳入的慢传输型便秘患者，随后挑选治疗有效的患者确定为最终动物实验的供体。然后，根据“人源化鼠模型”实验方案，将健康供体和慢传输型便秘供体的菌液移植至伪无菌鼠肠道内，观察并检测移植后小鼠的粪便性状和肠道动力变化。最后，进一步对慢传输型便秘患者的肠道菌群改变小鼠肠道动力的可能机制进行初步探索及分析。此课题研究旨在证实慢传输型便秘患者的肠道菌群是该疾病的有害因素之一，从而为临床运用菌群移植等肠道微生态理念治疗慢性便秘提供一定的理论依据。本课题共分为三个部分: 第一部分构建并观察伪无菌鼠的粪便性状和肠道动力表现 目的:目前认为肠道菌群是一个“被遗忘的器官”，各种疾病研究发现正常的肠道菌群结构对于调节机体的正常病理生理过程具有重要意义。通过构建伪无菌鼠模型，系统性地观察正常发育小鼠清除肠道菌群后粪便性状和肠道动力的变化情况，证实正常肠道菌群对肠道动力的重要调控作用。 方法:选取6周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，随机分为对照组和实验组，每组15只。在实验组饮用水中加入四联抗生素，分别为氨苄西林(1g/L)、新霉素(1g/L)、甲硝唑(1g/L)和万古霉素(500mg/L)，饮用水每隔一天换一次，连续处理4周。4周后，收集两组小鼠的新鲜粪便用于菌群分析;观察并记录每只小鼠24小时排便粒数、所有粪便干湿重以及粪便长度;通过Evansblue实验和球囊逼出实验检测两组小鼠的全消化道运输时间和结肠运输时间;最后，取小鼠盲肠称重并比较差异，以及通过平滑肌收缩力检测仪分析两组小鼠结肠平滑肌收缩变化情况。并且，通过给伪无菌小鼠重新移植SPF级C57BL/6小鼠肠道菌群的补充性实验，观察肠道动力以及粪便性状恢复情况。 结果:联合抗生素处理后，伪无菌鼠的肠道菌群数量、菌群多样性（Chao指数:354.3±42.9vs98.3±15.1,P＜0.01;Shannon指数:4.0±0.4vs0.5±0.1,P＜0.01;Ace指数:359.9±18.8vs112.7±5.5，P＜0.01;Sobs指数:341.0±19.1vs74.8±2.6，P＜0.01;Simpson指数:0.045±0.011vs0.769±0.029，P＜0.01）和物种丰度(OTU:383.4±23.4vs74.9±3.1，P＜0.01)显著降低。粪便性状方面，伪无菌鼠表现为24小时排便粒数减少、粪便长度增加、粪便含水量增加、以及盲肠体积和重量显著增大的现象。肠道动力方面，Evansblue实验和球囊逼出实验显示伪无菌鼠的全消化道运输时间和结肠运输时间均延长;平滑肌收缩力检测仪显示其近端结肠平滑肌收缩振幅显著降低。而重新移植入SPF级C57BL/6小鼠的肠道菌群后，伪无菌鼠的粪便性状和肠道动力得到明显恢复。 结论:联合抗生素处理后可得到伪无菌鼠模型，表现为肠道菌群数量及丰度显著降低，且肠道动力减弱;而伪无菌鼠模型在粪便性状以及肠道动力方面的表现在一定程度上验证了正常的肠道菌群结构有利于维持正常的肠道动力。 第二部分探讨慢传输型便秘患者的肠道菌群对粪便性状和肠道动力的影响 目的:虽然越来越多的研究表明慢性便秘患者的肠道菌群发生改变，且通过菌群移植重建患者的肠道菌群有利于治疗便秘。但是关于便秘患者的肠道菌群在其病理生理进展中是因还是果的问题目前尚不明确。本部分的研究将首次通过模拟“人源化鼠模型”实验方案探索慢传输型便秘患者的肠道菌群对于粪便性状和肠道动力的影响，从而判断紊乱的肠道菌群作为慢性便秘发生发展中有害因素之一的可能性。 方法:根据纳入和排除标准，选取2015年6月至2015年12月在我院收治的慢传输型便秘患者，留取其新鲜粪便制备成菌液并保存，待后续动物实验使用。选取的便秘患者均在我院普外研究所肠道微生态治疗中心接受菌群移植治疗，随访3个月并筛选治疗有效的6名患者作为供体纳入此部分研究。将预先联合抗生素处理的伪无菌鼠随机分为对照组(n=15)和实验组(n=30)，对照组和实验组小鼠分别予以预先制备的健康供体菌液和慢传输型便秘患者的菌液（灌胃，0.2mL/只/次，1次/周，共8周）。8周后，观察并记录每只小鼠24小时排便粒数、粪便干湿重和粪便长度;通过Evansblue实验和球囊逼出实验评价两组小鼠的全消化道运输时间和结肠运输时间;最后，通过平滑肌收缩力检测仪分析两组小鼠结肠平滑肌收缩力变化，以及通过电生理检测仪初步分析小鼠肠道的电生理变化。 结果:8周后，与对照组相比，在粪便性状上，实验组小鼠表现为排便粒数减少、粪便含水量降低以及粪便长度变短;在肠道动力方面，实验组小鼠表现为全消化道运输时间和结肠运输时间均延长，且结肠平滑肌收缩振幅明显降低，而电生理检测未见明显改变。 结论:慢传输型便秘患者的肠道菌群不利于维持正常肠道动力，促使小鼠表现为肠道动力不足以及类似便秘症状。所以，肠道菌群紊乱可能是慢传输型便秘的有害因素之一，为菌群移植治疗慢性便秘提供一定的理论价值。 第三部分探索并分析慢传输型便秘患者的肠道菌群影响肠道动力的可能机制 目的:前期临床及动物实验已显示，正常肠道菌群在维持肠道动力中发挥重要作用，且慢传输型便秘患者的肠道菌群在一定程度上抑制肠道动力，而可能机制尚不明确。因此，本部分课题旨在初步探索慢传输型便秘患者的肠道菌群影响肠道动力的可能信号通路与分子生物学机制。 方法:选取75只6周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组(n=15)和联合抗生素处理组(n=60)。处理4周后，将得到的伪无菌鼠随机分为三组，对照组(n=15)、健康菌液组(n=15)和便秘菌液组(n=30)，其中，健康菌液组和便秘菌液组小鼠分别予以预先制备的健康供体菌液和慢传输型便秘患者菌液（灌胃，0.2mL/只/次，1次/周，共8周），8周后分别取材。通过ELISA方法、Western-blot、qPCR、免疫荧光方法、高效液相/气相色谱分析等方法分析肠道组织形态学改变、肠道组织5-HT含量、肠道代谢产物（胆汁酸和短链脂肪酸）变化、肠嗜铬细胞代谢相关基因和蛋白检测等;通过给便秘菌液组小鼠补充外源性次级胆汁酸和短链脂肪酸，观察粪便性状和肠道动力的恢复情况。 结果:与健康菌液组相比，便秘菌液组小鼠表现为肠道5-HT含量明显降低，与5-HT产生相关的酶TPH-1表达降低，与5-HT吸收转运相关的蛋白SERT代偿性增加，作为肠道5-HT产生的底物色氨酸同样代偿性增加。进一步分析发现，便秘菌液组小鼠的肠道代谢产物发生改变，表现为次级胆汁酸含量和丁酸含量明显降低。最后，给便秘菌液组小鼠补充外源性次级胆汁酸和丁酸后，可相对有效地促进肠道动力恢复，一定程度上逆转便秘症状。 结论:肠道菌群参与调节结肠5-HT的代谢过程，而慢传输型便秘患者的肠道菌群可能通过影响肠道胆汁酸代谢和短链脂肪酸代谢过程干扰结肠5-HT的产生，从而表现为抑制肠道动力。
NETL