摘要
小麦白粉病是影响小麦产量的重要病害之一，发掘抗白粉病新抗源、克隆抗性相关基因并解析其作用机制，对于小麦抗性育种有重要指导意义。已有研究表明，特异存在于维管植物中的具有重金属结合结构域的法尼化类蛋白(HIPP)基因家族，参与植物生长发育、重金属离子解毒及平衡和病原菌防御等多个生物学过程，但目前在麦类植物中HIPP家族基因的研究少有报道。本实验室前期研究发现，来自簇毛麦的一个HIPP基因家族成员HIPP1-V在小麦-白粉菌互作中发挥重要作用，但其详细的作用机制尚不明了，此外，麦类植物中HIPP家族基因的数量、分布、结构和各自的功能也有待进一步研究。本研究在已有基础上，利用公布的麦类植物基因组和转录组等数据信息，系统鉴定麦类植物HIPP家族基因，分析其在不同物种中成员数量、分布、进化关系以及基因结构和表达特征，同时深入研究HIPP1-V正向调控小麦白粉病抗性的分子机理。 已有研究表明，叶绿体是植物最重要的细胞器，不但为植物生长发育提供能量，同时通过与核质的互动，调控ROS平衡等过程参与调控植物抗病性等逆境胁迫。植物叶色突变体是研究光合作用机理、解析植物细胞中叶绿体、细胞质、细胞核等协同作用调控生长发育、环境胁迫机理的重要材料。本研究在获得的HIPP1-V转基因再生植株群体中，发现其中一个植株表现抗白粉病，但同时发现与受体品种扬麦158相比，还表现叶片黄化、植株矮小、分蘖减少，在其自交后代这些突变性状和白粉病抗性均可以稳定遗传，将该突变基因定名为Tatyd，精细定位和克隆该基因，将有助于解析植物抗性机制，解析抗性与植物生长发育的关系。 本研究取得的主要结果如下: 1、麦类植物HIPP基因家族的鉴定和分析 (1)麦类植物HIPP家族基因数目和分布特征:在7个禾本科物种中共鉴定HIPP家族基因331个，根据拟南芥分类系统可将麦类植物HIPP分为5个分支，依次命名为CladeⅠ-CladeⅤ，其中CladeⅣ中基因数目最少（8个），而CladeⅡ中基因数目最多(152个)。在不同倍性麦类植物中，HIPP基因家族成员数目伴随倍性增加成倍增加，二倍体乌拉尔图小麦(T.urartu)、节节麦(Aegilopstauschii)、大麦(Hordeumvulgare)中分别有33个、40个和33个，四倍体野生二粒小麦（T.dicoccoides）有58个，六倍体普通小麦（Triticumaestivum）有114个。HIPP基因在二倍体基因组或多倍体各亚基因组的每条染色体上均有分布，但各个部分同源群上基因数目差别较大，最少为1-3个，最多为8-11个;同一部分同源群不同亚基因组HIPP基因的数量也不尽相同。除了四倍体或六倍体小麦4A染色体在物种进化过程中发生结构重排，HIPP基因在各个部分同源染色体分布上存在良好的共线性关系，为直系同源基因，表明大多数HIPP基因在麦类作物分化前就已形成，只有少数基因可能是麦类作物分化后独立进化产生或发生丢失。也可能是基因组序列信息缺失所致。 (2)麦类植物HIPP家族基因结构特征:基因结构分析发现，HIPP家族大多都含有2-3个内含子，所有HIPP蛋白均含有1-2个HMA（重金属结合结构域）结构域与C端的一个CaaX（法尼化结构域）基序。不同Clade之间基因结构与功能域有明显差异，同一Clade比较相似，如CladeⅣ中的8个基因大小、结构和功能域相似，但也存在微小差异，如CladeⅡ内基因大小，结构和功能域相对差异比较大。表明在生物进化的过程中，HIPP基因发生了明显的分化以行使不同的功能。 (3)小麦HIPP家族基因表达特征:利用公布的基因表达数据库，对小麦中HIPP基因表达特征分析表明，大部分HIPP类基因在根中的表达量最高，穗次之，籽粒最少;受生物胁迫（白粉菌和条锈菌）和非生物胁迫（干旱和热）诱导HIPP类基因都有不同程度的表达。分别比较两种生物胁迫下上下调表达以及不发生表达量变化基因的数目，发现共同上调基因18个，共同下调基因5个;比较两种非生物胁迫下上下调表达以及不发生变化基因的数目，发现共同上调基因11个，共同下调基因10个;四种胁迫下共同上调表达基因2个，没有共同下调表达基因。胁迫响应比较敏感的基因主要在根和叶片中表达，不敏感的基因主要在穗子和籽粒中表达。胁迫响应表达HIPP基因主要分布在CladeⅠ、CladeⅡ和CladeⅢ，而不响应胁迫或者自身表达量很低的基因主要分布在CladeⅣ和CladeⅤ。 2、簇毛麦HIPP基因家族克隆及HIPP1-V的功能作用机制解析 (1)簇毛麦HIPP基因家族克隆:在簇毛麦（Haynaldiavillosa）共克隆了13个HIPP基因。亚细胞定位发现，所有HIPP均存在细胞膜定位信号，但信号强弱存在差异，HIPP2/4/5/7/9/11-V的信号相对较弱;HIPP2-V和HIPP9-V等还有明显的细胞质定位信号。其亚细胞定位的差异可能与其功能分化有关。 (2)HIPP1-V的功能和作用机制解析:前期研究发现，簇毛麦CMPG1-V正向调控白粉病抗性，通过酵母双杂交试验发现HIPP1-V是CMPG1-V的互作蛋白之一，且也正向调控白粉病抗性，为解析其法尼化结构域和泛素化修饰对其功能的影响，通过定点突变，分别构建了法尼化结构域突变（HIPP1-VM1）、HMA结构域突变(HIPP1-VM2)、上面两个结构域同时突变(HIPP1-VM1+2)和可能被泛素化的15个赖氨酸住点同时突变(HIPP1-VM3)的突变基因。 HIPP1-V/CMPG1-V互作依赖于HIPP1-V的法尼化结构域和CMPG1-V的Arm结构域，HIPP1-V自身互作也依赖于法尼化结构域。利用酵母双杂及BiFC研究HIPP1-V与CMPG1-V之间的互作，结果显示，HIPP1-V与CMPG1-V全长互作，而HIPP1-VM1和HIPP1-VM1+2不能与CMPG1-V互作;除CMPG1-V的Arm结构域之外，其它区域不能与HIPP1-V互作，表明HIPP1-V的法尼化结构域和CMPG1-V的Arm结构域是互作必需的。此外，酵母双杂发现HIPP1-V可以发生自身互作，而HIPP1-V与HIPP1-VM1或HIPP1-VM1+2不能发生互作，表明HIPP1-V的自身互作也依赖于其法尼化结构域。 法尼化结构域是HIPP1-V膜定位必需的，HIPP1-V/CMPG1-V共定位主要位于细胞膜，且受Chitin诱导募集。亚细胞定位分析发现，野生型HIPP1-V和HIPP1-VM2主要分布在细胞膜、细胞核、内质网和一些运动的小泡当中，HIPP1-VM1细胞膜定位减少或消失。在烟草表皮细胞中同时表达HIPP1-V和CMPG1-V，发现二者共定位信号主要分布在细胞膜，几丁质(Chitin)诱导可以增强HIPP1-V与CMPG1-V在细胞膜和细胞核的共定位信号，而共同表达CMPG1-V与HIPP1-VM1或HIPP1-VM3均不能增强细胞膜上的共定位信号。表明法尼化结构域是其膜定位必需的，HIPP1-V可以与CMPG1-V在膜上互作，Chitin诱导可以募集膜定位的HIPP1-V/CMPG1-V复合体。 法尼化结构域及泛素化修饰影响HIPP1-V在抗白粉病过程中的功能。为解析HIPP1-V功能，研究其不同结构域和泛素化修饰对其功能的影响，分别利用小麦表皮细胞中瞬时和稳定过量表达研究不同突变基因的功能。结果表明，在感病品种扬麦158幼嫩叶片，瞬时共表达GUS和HIPP1-V(HI=34.38％)或HIPP1-VM2(HI=32.28％)较单独表达GUS基因(HI=62.77％)，可以显著降低接种白粉菌的吸器指数，而瞬时共表达GUS和HIPP1-VM1(HI=51.7％)、HIPP1-VM3(HI=58.39％)和Ub-HIPP1-V(HI=56.28％)对吸器指数无明显影响。在扬麦158中过量表达HIPP1-V、HIPP1-VM和HIPP1-VM2获得转基因植株，发现HIPP1-V和HIPP1-VM2转基因阳性植株均高抗白粉病，HIPP1-VM1转基因阳性植株不能提高白粉病抗性。表明HIPP1-V正向调控小麦白粉病抗性，法尼化结构域及泛素化修饰会直接影响HIPP1-V在抗白粉病过程中的功能。 HIPP1-V在金属离子结合中也发挥作用，HMA结构域影响该功能。HMA结构域对HIPP1-V的抗白粉病功能无明显影响，为解析其HMA结构域的功能，比较了转基因植株与受体亲本对重金属Cd胁迫的反应。结果表明，在不同浓度Cd离子胁迫下，HIPP1-V转基因植株的根长与株高显著高于受体扬麦158，表明HIPP1-V基因调控小麦对Cd的耐受性。原核表达并纯化His-HIPP1-V和His-HIPP1-VM2蛋白，通过ICP-MS检测不同蛋白的金属含量，分析显示His-HIPP1-V蛋白中大部分金属离子浓度均高于His-HIPP1-VM2蛋白，特别是K+、Ca2+、Mn2+、Pb2+离子的含量。以上结果说明HIPP1-V可以结合金属离子，且HMA结构域中的半胱氨酸残基对金属离子的结合至关重要。 3、普通小麦扬麦158黄化矮杆寡分蘖突变基因Tatyd的精细定位 本研究前期在HIPP1-V转基因再生植株T0代，发现一个抗白粉病植株同时表现黄化矮杆寡分蘖，为明确抗性提高是否与HIPP1-V转基因过量表达有关，利用qRT-PCR进行表达分析，发现该植株中HIPPs的表达与扬麦158无明显差异。因此，推测是转基因组织培养过程发生了基因突变，将该突变体命名为Tatyd。 Tatyd突变体表型、生理生化特征分析。对突变体和野生型叶色相关指数比较发现，Tatyd旗叶SPAD值、最大光量子产量Fv/Fm、叶绿素含量指数Chl-index及净光合速率均显著低于扬麦158，整个生育期表现黄化;不同组织全氮(N)及氨基酸含量测定发现，Tatyd叶片中N和不同氨基酸的积累低于扬麦158，但在其它组织中，Tatyd全N和不同氨基酸的积累均高于扬麦158，推测由于叶片黄化导致N及氨基酸的积累受阻，但同时也促进了其它组织相关物质的积累;农艺性状考察发现，Tatyd株高、分蘖、粒长和粒宽以及千粒重均显著低于扬麦158。 Tatyd突变性状遗传分析。利用Tatyd分别与扬麦158和人工合成六倍体小麦W7984杂交，两个组合的杂种F1均表现为叶片黄化的突变性状，F2发生黄叶和绿叶的表型分离，分离比例符合3∶1(卡方(Tatyd×W7984)=1.069，卡方(Tatyd×扬麦158)=0.018，p＞0.05），表明Tatyd黄化性状是单基因控制的显性性状;对黄化性状与株高、分蘖、穗长相关性分析发现，均呈显著负相关，推测是一因多效导致。 突变基因Tatyd的精细定位。首先利用集群分析法(BSA)进行初步定位。构建了Tatyd×W7984F2群体中各包含10个F2单株的绿叶池（野生型）和黄叶池（突变型），分别利用SSR标记和小麦55KSNP基因分型芯片进行关联分析，将Tatyd黄化基因初步定位在2DS上;进一步对F2群体进行连锁分析，构建Tatyd区域遗传图谱，将Tatyd基因定位在两个SSR标记WMC111和gwm296之间，遗传距离分别为1.3cM和0.6cM，物理距离为3.24Mb。为精细定位Tatyd基因，参考中国春基因组序列及55KSNP芯片结果，在Tatyd基因的定位区间内开发具有多态的SSR和SNP标记，以WMC111和gwm296两个SSR标记为侧翼标记，在1390个F2单株和442个F2∶3单株中，共筛选到17株交换单株，可分为7种重组类型，进一步将Tatyd基因精细定位在2DS端部两个标记zh47和gwm296之间，物理距离约为0.76Mb。为进一步克隆该基因奠定了基础。
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