摘要
小麦白粉病(Wheatpowderymildew)是危害小麦生产的世界性病害。发掘鉴定新的抗性基因，选育和应用高抗白粉病的小麦品种，是控制该病害的最经济有效的途径之一。提摩菲维小麦(Triticumtimopheevii2n=4x=28，AAGG)小麦的亲缘物种，具有抗白粉病、抗锈病等多个优良性状，是栽培小麦的二级基因库。位于提摩菲维小麦2G染色体上的抗白粉病基因Pm6目前仍表现出很好的成株抗性。深入研究提摩菲维小麦抗白粉病遗传和分子机制，发掘新的抗性基因具有重要意义。 本实验室在前期研究中，利用普通小麦-提摩菲维小麦渐渗系IGVI-463与Prins构建F2群体，开发筛选出与Pm6紧密连锁的RFLP标记Xbcd13和Xbcd266(Tao等，2000);纪剑辉等在此基础上开发了两个STS标记，并利用一套渐渗系将Pm6基因定位于2B染色体长臂近末端2BL-6区域[Fractionlength(FL)0.50-1.00](纪剑辉等，2007);Qin等(2011)通过分子标记开发和比较基因组学分析，预测染色体2B长臂上的LRR-RLK基因簇可能是Pm6基因候选基因;陈婷婷(2013)在此基础上在普通小麦-提摩菲维小麦渐渗系IGVI465中克隆了两个LRR-RLK基因，TaLRR-RLK1和TaLRR-RLK2，发现两个基因都在小麦抗白粉病中发挥正向调控作用。为了进一步明确LRR-RLK与Pm6基因的关系，研究LRR-RLK在小麦抗白粉病中的功能，本研究在以上研究基础上，从提摩菲维中克隆了LRR-RLK的同源基因，并利用转基因技术研究其功能;此外，还进一步研究了TaLRR-RLK在2B染色体长臂上的区段定位，明确其与Pm6基因的异同，分析了活性氧通路在TaLRR-RLK1和TaLRR-RLK2介导的抗白粉病中的作用。取得的主要研究结果如下: 1、提摩菲维小麦TiLRR-RLK基因的克隆 以受白粉菌诱导后不同时间段的提摩菲维叶片cDNA为模板，利用TaLRR-RLK1和TaLRR-RLK2的RACE全长引物(577-5-15-1-F/633-3-3-R，577-5-15-2F/3UP-R)克隆得到ORF为3051bp的全长cDNA基因，编码1016个氨基酸的蛋白质，包含信号肽、LRR结构域、跨膜域和胞内激酶域，属于LRR类受体蛋白激酶，将该基因命名为TiLRR-RLK。 2、TiLRR-RLK基因的遗传转化 利用基因枪介导的遗传转化技术，将CAMV35S启动子驱动的TiLRR-RLK基因转化扬麦158幼胚愈伤组织，经3轮筛选分化，共获得99株T0代再生植株;利用CaMV35S-F和LRR-RLK-R引物进行PCR鉴定，结果发现其中4株为TiLRR-RLK转基因阳性植株;选择3株转基因阳性植株(TiLRR-RLK23，TiLRR-RLK54，TiLRR-RLK72)和6株转基因阴性植株（TiLRR-RLK19，TiLRR-RLK48，TiLRR-RLK51，TiLRR-RLK56，TiLRR-RLK62和TiLRR-RLK102）进行qRT-PCR分析，结果发现，TiLRR-RLK54和TiLRR-RLK72中目的基因上调表达，相比较受体扬麦158分别上调表达2.5倍，4倍。而TiLRR-RLK23相比较受体扬麦158上调表达1.15倍，表达没有明显变化;在6株转基因阴性植株中基因(TiLRR-RLK19，TiLRR-RLK48，TiLRR-RLK51，TiLRR-RLK56，TiLRR-RLK62和TiLRR-RLK102)相比较受体扬麦158分别上1.4倍、1.2倍、0.8倍、1.3倍、0.9倍、1.1倍，表达也没有明显变化。 用南京地区混合小麦白粉菌对以上9份转基因材料进行苗期离体抗性鉴定，结果表明，3株的T0代阳性转基因植株均表现抗病，PCR鉴定发现其衍生的T1代转基因植株均为阳性，未出现分离;苗期离体白粉病抗性出现抗感分离，而成株期均表现抗病。表明TiLRR-RLK基因过量表达可以提高小麦品种扬麦158的白粉病抗性。 3、LRR-RLK基因的染色体区段定位 利用A、D基因组中TaLRR-RLKs的DNA序列，开发能够区分A、B、D和G基因组的LRR-RLK基因的特异性标记。在普通小麦中国春缺体四体N2A/T2B、N2B/T2D、N2D/T2B和渐渗系IGVI465、IGVI464、IGVI463、IGVI468、IGVI458、IGVI474、IGVI466以及提摩菲维小麦和小麦品种Prins中扩增，发现该引物可以在四个不同的基因组中扩增出特异条带;来自2G的特异条带在渐渗片段较小的IGVI465、IGVI464、IGVI463中不能扩增出，而在渐渗片段较大的IGVI468、IGVI458、IGVI474、IGVI466中能扩增出来，表明2G染色体上的LRR-RLK基因即TiLRR-RLK定位于2G长臂靠近着丝粒区段，与Pm6基因位于不同区段。 4、ROS在TaLRR-RLK阶导的小麦抗白粉病中的作用 利用DAB染色法比较受白粉菌诱导后扬麦158、Prins、IGVI465、转基因阳性株系TaLRR-RLK1-62和TaLRR-RLK2-143的过氧化氢积累情况。结果发现，白粉菌诱导后24h，IGVI465、TaLRR-RLK1-62和TaLRR-RLK2-143的DAB染色明显，而扬麦158、Prins的DAB染色则没有明显变化。进一步测定其活性氧含量和ROS相关酶(CAT、POD、SOD)的活性，结果发现，经过白粉菌诱导一定时间后，TaLRR-RLK1-62、TaLRR-RLK2-143、IGVI465、IGVI466和提摩菲维小麦内源过氧化氢含量、CAT、POD、SOD酶活活性均有显著增加，而扬麦158、Prins和转基因阴性株系TaLRR-RLK2-8中则均无明显变化。表明LRR-RLK介导的白粉病抗性信号通路可能与活性氧有关。
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