摘要
本论文包括两部分研究内容，第一部分为水稻粒型基因SGL(SHORTGRAINLENGTH)的图位克隆和功能分析，第二部分为水稻种子休眠QTLqSdn-5的图位克隆和候选基因功能的初步分析。 第一部分:水稻粒型是一个非常复杂的性状，它决定了水稻的产量和品质。本研究中，sgl是从粳稻品种kita-ake的组培后代中筛选到的短粒突变体，同时株高变矮。通过基因的图位克隆和功能分析，揭示了突变体sgl粒型及株高变异的遗传和分子机制，为水稻粒型及矮化突变体在育种上的应用提供理论依据。主要研究结果如下: 1.表型方面，sgl较kita-ake籽粒粒长变短，粒宽变宽，粒重减小。此外，sgl还表现出株高变矮，各个节间缩短等表型。通过颖壳表皮细胞的扫描电镜观察及茎杆细胞的石蜡切片观察，我们发现突变体中细胞较野生型明显变小，这可能是导致突变体出现籽粒变短及矮化表型的主要原因。 2.通过图位克隆我们将sgl定位在第5染色体短臂94kb的区间内。利用基因预测数据库对定位区间进行基因预测，发现该区段包含12个候选基因。测序发现Os05g0154700的5''端非编码区存在一个碱基G的缺失。qRT-PCR及westernblot结果显示这个碱基G的缺失导致这个基因转录水平及翻译水平的表达量较野生型都显著降低。SGL编码一个已知的kinesin13家族蛋白SRS3。 3.表达分析表明SGL在根、茎、叶、穗等组织中都有表达，且在茎及幼稳中表达量较高，这和突变体出现多个表型变异的结果相一致。在洋葱表皮细胞中，SGL主要定位在细胞核中，但在细胞的其它一些部位也存在。 4.外源GA处理的结果表明sgl可能是一个GA缺陷型的突变体。荧光定量结果显示GA合成及代谢相关基因的表达和野生型中存在很大差异，主要表现在编码GA合成上游的酶的基因如OsKOs在突变体中的表达量显著降低，而编码GA合成下游一些酶的基因如GA20ox及GA3ox在突变体中的表达量显著升高。 5.蛋白结构分析发现SGL含有一个bZIP转录因子中保守的亮氨酸拉链基序。酵母中转录激活活性检测结果显示SGL和bZIP转录因子一样具有转录激活活性。已知bZIP转录因子可以结合RF2a，CCA(N)nTGG基序，序列分析发现在GA合成基因OsKOs的启动子区域含有与RF2a基序相似的K2基序。利用烟草瞬时表达体系我们证实SGL可以通过结合K2基序并激活下游基因的表达。因此，突变体中SGL的变异导致GA合成及代谢基因表达发生变化，最终影响水稻植株的生长发育。 第二部分:水稻种子穗发芽严重影响稻米的产量和品质，而种子休眠性和抗穗发芽密切相关。种子休眠是一个非常复杂的数量性状，精细定位和克隆休眠QTL不仅有助于阐明水稻种子休眠调控的分子机制，同时还可以利用分子标记辅助选择的方法，提高抗穗发芽的育种效率。本研究在前人初定位的基础上对控制种子休眠性的QTL位点qSdn-5进行图位克隆及功能分析，为揭示种子休眠的分子机制奠定良好的基础。主要结果如下: 1.在前人初定位的基础上最终将控制种子休眠性的QTL位点qSdn-5精细定位在第5染色体长臂Indel标记D9和D7之间，物理距离约50kb。通过预测发现，定位区间包含8个ORFs。其中ORF3、ORF6及ORF8的编码区在N22和南粳35(NJ35)之间存在差异，因此我们对这三个基因进行转基因验证。 2.首先，我们将ORF3、ORF6及ORF8在南粳35中过表达，通过对过表达T1、T2和T3代转基因植株的种子休眠表型进行鉴定，我们发现过表达ORF6可以显著地提高南粳35的休眠性。同时，我们利用RNAi干扰技术将N22和NIL5中的ORF6敲除来验证其功能，目前得到T0代转基因苗。 3.ORF6编码一个氧化还原酶，参与蛋白质二硫键的形成。表达分析结果表明ORF6在水稻的各个组织中都有表达，在种子中表达量较高，同时其表达量随种子发育进程不断增加;在水稻原生质体中ORF6定位在高尔基体中。 4.体外酶活测定实验表明在强休眠的NIL5中qSdn-5的酶活显著高于无休眠的南粳35中qSdn-5的酶活，暗示NIL5和南粳35间休眠性的差异可能是二者之间qSdn-5的酶活差异导致的。 5.种子发育后期NIL5及过表达家系种子中过氧化氢含量显著低于南粳35，而NIL5种子中α-淀粉酶的活性也显著低于南粳35，这些结果均与发芽表型相一致。同时我们发现NIL5种子中ABA的含量略低于南粳35，而NIL5对ABA的响应更加敏感。另外AtDOG1的同源基因OsDOG1L-1及OsDOG1L-2在NIL5的表达量显著高于南粳35，说明qSdn-5可能通过调控AtDOG1同源基因的表达来调控种子的休眠。
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