摘要
果实成熟，是指果实完成生长发育之后，发生一系列生理生化变化过程的集合，这一过程也是影响果实的采后品质以及贮藏时间的关键因素。梨是我国栽培面积最广的果树之一，梨果实因其具有甜美多汁，肉质细腻，皮薄个大等特点，受到消费者喜爱，作为呼吸跃变型水果，梨在成熟过程中会释放大量乙烯从而加快果实成熟，可见，乙烯是梨果实成熟的重要促进因子。人们为了提早或延长果实的成熟期，获得更大的经济效益，通常采取喷施乙烯利、1-MCP和冷藏保存等措施，这样不仅增加了生产成本，消耗大量资源，还对环境产生不良影响。因此挖掘调控果实成熟的关键基因，阐明梨果实成熟的分子调控机制和调控网络，对控制梨果实成熟过程，提高果实采后品质以及延长贮藏时间具有重要的理论和实践意义。 梨果实成熟是涉及许多基因综合表达调控的结果，转录因子在其中发挥了重要作用。在本研究中，为了解析转录因子调控果实成熟的分子调控机制和调控网络，我们通过生物信息学和转录组数据分析，筛选到了参与调控果实成熟的HB和IAA基因，利用瞬时转化验证基因的功能，并通过分子生物学和细胞生物学实验发掘了它们的互作蛋白，进一步阐述了它们调控果实成熟过程中乙烯合成的分子机制，对于完善梨果实成熟的分子调控信号网络具有重要作用。其主要结果如下: 1、以梨果实发育成熟各个时期HB家族的转录组数据为基础，用qRT-PCR进行验证，筛选到了一个HB家族成PbrHB.G7.2，发现其表达受到果实成熟的诱导。通过将PbrHB.G7.2在梨果实中进行瞬时转化、烟草中双荧光素酶报告实验、酵母单杂交实验和凝胶电泳迁移实验，发现PbrHB.G7.2可以直接结合并激活PbrACS1b的P9部分启动子（起始密码子前200-300bp），提高其转录水平，从而加速乙烯的合成，促进果实成熟。经过酵母文库筛选、酵母双杂交实验以及烟草荧光素酶互补实验，我们找到了与PbrHB.G7.2蛋白互作的两个转录因子PbrHB.G1和PbrHB.2.1。为明确它们的互作区域，我们对PbrHB.G7.2、PbrHB.G1和PbrHB.2.1进行分段酵母双杂实验，发现PbrHB.G7.2的D+C段与PbrHB.G1和PbrHB.2.1的D段互作，烟草荧光素酶互补实验也验证了这一结果。接下来在双荧光素酶报告实验、酵母单杂交试验和凝胶电泳迁移实验中，发现PbrHB.G1能够直接结合并激活PbrACS1b的P16部分启动子（起始密码子前1700-1800bp)，而PbrHB.2.1同样能够直接结合并激活PbrACS1b的P17部分启动子(起始密码子前940-1060bp)，但是当PbrHB.G1和PbrHB.2.1与PbrHB.G7.2蛋白互作时，对于PbrACS1b的启动子的激活作用消失了。上述结果阐明了PbrHB.G7.2能够调控梨果实成熟过程中乙烯合成的分子机制，明确了PbrHB.G7.2及其互作蛋白PbrHB.G1和PbrHB.G2.1调控乙烯合成的分子网络。 2、我们分离并鉴定了梨树中Aux/IAA基因，根据转录组数据分析了Aux/IAA基因在梨果实发育成熟各个时期的表达水平，并用qRT-PCR进行验证，筛选到了一个在梨成熟果实成熟过程中的表达水平显著提高的Aux/IAA家族成员PbrIAA.C3。后期，通过将PbrIAA.C3在梨果实中瞬时转化，发现PbrIAA.C3基因的表达能够提高PbrACS1b的转录水平，产生更多的乙烯，加快果实成熟。双荧光素酶报告实验、酵母单杂交实验，发现PbrIAA.C3可以直接结合并激活PbrACS1b的P9部分启动子（起始密码子前200-300bp）。经过酵母文库筛选、荧光素酶互补实验和酵母双杂实验，我们找到了PbrIAA.C3的互作蛋白PbrARF51。进一步地双荧光素酶实验发现，PbrIAA.C3与PbrARF51互作后抑制了PbrACS1b启动子的活性。总之，上述结果找到了调控果实成熟的Aux/IAA家族基因PbrIAA.C3，发掘了PbrIAA.C3的互作蛋白PbrARF51，揭示了PbrIAA.C-PbrARF51蛋白复合体调控果实成熟过程中乙烯合成的分子机制。
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