摘要
日本医蛭(HirudonipponiaWhitman)是无吻蛭目(ArhynchobdellidaBlanchard)、医蛭形亚目(HirudiniformesCaballero)、医蛭科(HirudinidaeWhitman)、医蛭属(HirudoLinnaeus)动物，是《中国药典》(2015年版)收藏药材水蛭的基原动物之一，以其干燥全体入药，于夏、秋两季采收，用沸水烫死、晒干或低温干燥。具有破血通经，逐瘀消癥的功效。用于血瘀经闭，癥瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤，在防治心脑血管疾病方面具有特效作用。 日本医蛭在我国分布广泛，北起东北各省和内蒙古，西至四川、甘肃，南到台湾和两广;国外在日本、韩国、俄罗斯及蒙古均有发现。主要栖息在水田、沟渠、池塘、沼泽等常年积水的田地中，靠吸食人、畜和两栖类动物的血液为生。为了进一步理解水蛭吸食血餐的过程，目前已有许多学者对多种吸血类水蛭唾液腺进行了转录组测序，筛选、鉴定出一系列用于抵抗寄主止血系统的抗凝降栓类蛋白的转录本，如hirudin、eglinC、antistasin、saratin、decorsin、ornatin、leechantiplateletprotein(LAPP)和destabilase等。然而，日本医蛭唾液腺的研究鲜见报道。 为探讨日本医蛭唾液腺摄食血餐相关基因，本研究将日本医蛭进行摄食血液处理，以未摄食血餐的日本医蛭唾液腺作为对照组(unfedgroup，UFG)，正在摄食组(feedinggroup，FIG)为开始摄食后20min的日本医蛭，摄食后1d的日本医蛭组(fedgroup，FG)，即充分摄食后24h的水蛭。将上述三组水蛭唾液腺混合后进行转录组测序，分析、鉴定抗凝降栓类物质的转录本;再分别对上述三组水蛭唾液腺进行表达谱测序，分析、鉴定水蛭唾液腺摄食相关的基因;将筛选得到的基因进行生物信息学分析及通过qRT-PCR技术验证其表达模式，选择序列完整、注释信息可信的基因序列进行原核表达，进一步分析它的生物学功能，为水蛭唾液腺摄食相关基因功能的进一步研究提供参考。主要研究结果如下: (1)将日本医蛭三个摄食时期唾液腺样品混合后建立cDNA文库，利用BGIseq-500测序平台进行转录组测序。测序共获得6.5Gb数据，组装、除冗后共得到41895条Unigene，总长度、平均长度、N50以及GC含量分别为46785456bp、1116bp、1968bp和42.12％，测序所得数据上传NCBI数据库(SRP151118)。将Unigene比对七大功能数据库进行注释，最终分别有24723(NR:59.01％)、7542(NT:18.00％)、20526(SwissProt:48.99％)、19303(KOG:46.07％)、19862(KEGG:47.41％)、7549(GO:18.02％)以及19707(InterPro:47.04％)条Unigene获得功能注释。筛选并汇总了具有与抗凝、降栓相关功能的转录本，通过生物信息学方法评估转录本的完整性及功能注释的可信度。最终筛选得到凝血酶抑制剂、血小板聚集抑制剂、Xa因子抑制剂和溶栓剂等药理作用蛋白的转录本。 (2)从上述转录组数据库中筛选具有潜在抑制凝血酶活性基因的转录本时发现，转录本unigene5370被注释到欧洲医蛭(Hirudomedicinalis)的hirudinHV3(1e-29)，将unigene5370命名为hirudin-HN基因。该转录本是一种新型凝血酶抑制剂基因，隶属于蛋白酶抑制剂I14（水蛭素）家族。Hirudin-HN长270bp，编码的蛋白具有89个氨基酸，其中有20个氨基酸为信号肽。成熟hirudin-HN蛋白包含了典型水蛭素的结构特点:三个保守的二硫键、PKP结构和DFxxIP结构。通过原核表达获得hirudin-HN蛋白(Hir和M-Hir)，运用生物底物S2238法检测发现，成熟hirudin-HN蛋白(Hir和M-Hir)均具有抑制凝血酶活性的作用，利用表面等离子体共振(SPR)的方法检测发现，成熟hirudin-HN蛋白(Hir和M-Hir)均与凝血酶具有很强的亲和力。利用qRT-PCR和WB技术检测mRNA表达量和蛋白含量发现，处于饥饿时期的日本医蛭唾液腺(UFG)中hirudin-HN的mRNA表达量及蛋白含量均明显高于FIG和FG组中的含量。这些结果为进一步研究hirudin-HN与凝血酶结构与功能的关系奠定了基础。 (3)从上述日本医蛭唾液腺转录数据库中筛选到转录本unigene3091，FPKM值为12283.46，注释到菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis的Hirudin-HM1，E值为2e-14。该基因长237bp，编码的蛋白具有77位氨基酸，其中有20位氨基酸为信号肽。通过氨基酸序列比对，发现该转录本具备hirudin典型的三个二硫键结构，使蛋白质N端形成紧密结构，但未发现hirudin其它结构，如PKP和DFxxIP等。利用unigene3091对应的氨基酸序列构建系统进化树，与水蛭素类因子(hirudin-likefactors，HLFs)聚为一类。因此，将该基因命名为hirudin-likefactor-HN基因(HLF-HN)。通过原核表达获得成熟HLF-HN蛋白，运用生物底物S2238检测方法发现，成熟HLF-HN蛋白具有抑制凝血酶活性的作用。研究结果为吸血类水蛭hirudin-likefactor基因的研究提供理论基础。 (4)日本医蛭在摄食血餐期间唾液腺产生和分泌多种药理活性成分，从而有效地完成血液的摄食过程。本研究构建了日本医蛭唾液腺三个摄食血餐时期(UFG、FIG和FG)的cDNA文库（各三次重复），利用BGIseq-500平台(BGI)对cDNA文库进行表达谱测序分析，共获得216161299条rawreads。筛选三个时期差异表达基因(Differentiallyexpressedgenes，DEGs)，并将FIG组特异高表达的基因定义为摄食相关基因，通过生物信息学方法分析及评估摄食血餐相关基因。结果表明，免疫相关基因、血管舒张相关基因、消化相关基因和发育相关基因等基因的表达参与了日本医蛭唾液腺摄食血餐的过程。 (5)从日本医蛭不同摄食血餐时期唾液腺表达谱差异表达基因中筛选得到转录本unigene379，该基因全长411bp，编码蛋白质序列全长为136个氨基酸，其中N端包含21个氨基酸的信号肽。氨基酸序列比对发现，该序列具备溶菌酶保守的14个半胱氨酸，形成7个二硫键。利用促溶Trx标签蛋白，获得了可溶性融合蛋白Trx-Des，利用凝血酶分离标签蛋白Trx与Des蛋白后，检测Des蛋白活性发现，Des蛋白具有溶菌酶的活性，无溶解纤维蛋白的活性。 综上所述，对日本医蛭不同摄食血餐时期唾液腺进行无参转录组测序分析，筛选出相关抗凝血候选基因。通过原核表达获得了hirudin-HN和hirudin-likefactor-HN基因的蛋白，验证了它们具有抑制凝血酶的活性，并模拟三维结构模型方面分析了hirudin-HN与凝血酶的互作关系。通过RNA-seq筛选日本医蛭唾液腺摄食相关基因，发现免疫、血管舒张、消化和发育等相关基因的表达参与了日本医蛭唾液腺摄食血餐的过程。通过原核表达获得destabilase-HN基因的蛋白，并验证了该蛋白的溶菌酶活性。本研究表明，日本医蛭为成功安全地摄食血餐，其唾液腺可能表达了一系列具有潜在抗凝血、抑菌等活性的摄食相关基因。
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